[发明专利]一种心肌肌钙蛋白I的高灵敏定量检测方法

说明书

本发明涉及一种心肌肌钙蛋白I的高灵敏定量检测方法，属于生物医学检测技术领域。本发明所述检测方法是通过核酸适配体对心肌肌钙蛋白I进行特异性识别，并利用核酸的滚环扩增技术和基于氧化石墨烯的荧光共振能量转移技术，实现对cTnI的准确灵敏的定量检测；所述检测方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便以及成本低等优点，符合临床检测的需求。

技术领域

本发明涉及一种心肌肌钙蛋白I的高灵敏定量检测方法，属于生物医学检测技术领域。

背景技术

心肌肌钙蛋白是心肌的收缩调节蛋白，由心肌肌钙蛋白I(cTnI)、心肌肌钙蛋白C(cTnC)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)三个亚单位构成，其中cTnI由于具有高度的心肌特异性，成为临床诊断心肌梗死的首选标志物。cTnI的高灵敏检测对于提高临床上急性心肌梗死的早期诊断率、快速分诊、危险分层和预后评估具有重要意义。

目前常见的cTnI定量检测方法包括放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光法、试纸条快速检测等，这些方法对cTnI的检测灵敏度通常在ng/mL水平，难以满足临床诊断对cTnI高灵敏检测的需求，因此建立准确灵敏的cTnI定量检测方法对心肌梗死的早期诊断具有重要的现实意义和临床应用价值。

近年来，由于核酸的易合成、易修饰和可扩增的特点，使得基于核酸的高灵敏度蛋白检测方法受到广泛关注。目前涌现出了许多新型的高灵敏的检测方法，如免疫聚合酶链式反应、免疫滚环扩增反应(IRCA)、邻位连接技术等，这些检测方法的灵敏度与特异性都明显高于传统的ELISA方法。其中，滚环扩增技术(RCA)是借鉴自然界中环状病原生物DNA分子滚环式复制方式建立的核酸扩增技术，在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下由一条引物即可引发沿环形DNA模板的链置换合成，实现环状DNA模板的体外等温线性扩增，具有灵敏、特异、操作简便的特点。将普通RCA技术与抗原抗体的免疫反应相结合产生了IRCA方法。在该方法中，识别靶分子的抗体上结合了一段可以与环状模板互补的寡核苷酸引物，在具有链置换或解旋活性的酶的作用下，扩增出一条由多段与环状模板互补的重复序列构成的单链DNA。

值得一提的是，IRCA方法中作为探针分子的抗体，易受pH、温度等环境条件的影响而变性，且合成价格昂贵。而经指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选出来的核酸适配体是一段DNA/RNA序列，能够与多种目标物质进行高选择性、高特异性的结合，已被广泛地用于生物传感器领域。相比于抗体，核酸适配体能发生亲和作用的范围更广，成本更低，易于修饰且性质更稳定。因此，核酸适配体作为探针分子在蛋白检测领域具有广阔的发展空间。到目前为止，基于核酸适配体对cTnI的特异性识别、核酸的滚环扩增及荧光共振能量转移技术的cTnI定量检测方法未见报道。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种心肌肌钙蛋白I的高灵敏定量检测方法，主要是通过核酸适配体对心肌肌钙蛋白I进行特异性识别，并利用核酸的滚环扩增技术和基于氧化石墨烯(GO)的荧光共振能量转移技术，实现对cTnI的准确灵敏的定量检测，所述检测方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便以及成本低等优点。

本发明的目是通过以下技术方案实现的：

一种cTnI的高灵敏度定量检测方法，所述方法步骤如下：

(1)将包被缓冲液稀释后的cTnI抗体包被至黑色酶标板上，然后在37℃下孵育2h；

(2)弃去黑色酶标板上的液体，再加入封闭液，并在4℃下封闭1h以上；

(3)弃去黑色酶标板上的液体，用PBST洗涤黑色酶标板3～5次，且完成最后一次洗涤后，倒去液体并拍干；

(4)将黑色酶标板上的孔划分成不同的实验组，分别将不同浓度的cTnI以及含cTnI的待测样品加入到不同的实验组中，然后在37℃下孵育1h；

(5)重复步骤(3)的操作；