[发明专利]一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法

摘要

一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法，该方法包括菌丝多糖多肽的物理方法与酶解相结合的高效提取、乙醇沉淀分离、左旋咪唑和高浓度乙醇分别沉淀纯化、复合免疫增强注射剂的配伍制剂等步骤。可与疫苗混合或配合注射剂提高动物免疫，生产效率高，相对生产成本低。本发明开发的松乳菇菌丝多糖基于其组成单糖较简单，可以进一步分解制备稀有功能性单糖，工艺简单。

主权项

一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)菌丝发酵物的制备：以液态深层发酵方法培养松乳菇、金针菇、香菇、猴头菇、松茸等食药真菌菌丝，25‑30℃，100‑180r/min培养2‑4d，制备食药真菌菌丝发酵物，包括菌丝与发酵液。(2)多糖多肽提取：菌丝发酵物→研磨或高压均浆破碎菌丝→加0.05‑0.2％(w/v)的复合酶(纤维素酶：果胶酶＝1.5：2‑3)进行第一次酶解(PH5,50℃,2‑3h),80‑90℃灭活10‑20min；用中性蛋白酶(木瓜蛋白酶等)第二次酶解(pH7.0，50℃，2‑3h，用酶量32万U/100ml),→微波(120S～180S)或超声波(400W，50‑60℃,40‑60min)处理→过滤→4000‑5000rpm离心10‑20min,得多糖与多肽粗提取液；(3)多糖多肽分离：粗提液减压浓缩，加乙醇至乙醇体积百分比浓度为70—75％，搅匀，静止沉淀过夜，使提取液中的多糖和多肽初步分离，得作为沉淀物的粗多糖和作为上清液的粗多肽；(4)粗多糖多肽纯化：1)粗多糖的纯化：将乙醇沉淀物水溶解，4号垂溶漏斗过滤后取滤液；加盐酸左旋咪唑使其体积百分比浓度为0.1—0.5％，煮沸15min，静置过夜，使蛋白与盐酸左旋咪唑结合沉淀，取上清液，280nm处测定无蛋白，离心；将上清液用碱调PH至7—8，按体积加入2—8％过氧化氢(w/v),于50—70℃脱色2—3h；加石油醚和氯仿分次萃取脱脂、脱色和残存左旋咪唑；超滤除菌和大分子物质；于60—80℃减压浓缩或纳滤膜过滤浓缩后进行冷冻干燥或真空干燥，或超滤后直接喷雾干燥，制得无菌纯化真菌多糖。2)粗多肽的纯化：取乙醇沉淀的上清液低温减压回收乙醇，再用体积百分比浓度为80％、85％、90％、95％的乙醇依次沉淀，至无沉淀(大分子蛋白、多糖等)后，于50—70℃减压回收乙醇；如有脂肪存在(香草醛比色法或尼罗红染色法检测)，再经乙醇、丙酮、乙醚分步脱脂；配制成水溶液，加0.5‑1.5％活性炭脱色(搅拌2h，静置10min)，超滤除菌和大分子物质；滤液经纳滤膜过滤浓缩或50—70℃减压浓缩后进行冷冻干燥或真空干燥；制得无菌纯化真菌多肽。(5)复合免疫增强剂配伍制剂：1)粉针制剂：将所得的无菌纯化真菌多糖、真菌多肽按质量比(2—5)：(1—5)配伍，无菌分装，制得药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强粉针剂。也可按质量百分比加1‑5％盐酸左旋咪唑(注射用)制备左旋咪唑多糖多肽粉针。临用时用注射用水或生理盐水配制。2)水针制剂：将纯化多糖多肽按质量比(2—5)：(1—5)取样，配制成10‑30％(w/v)水溶液，超滤膜过滤，在无菌条件下分装于经高压消毒的药瓶内，巴氏消毒老化一体机中进行巴氏消毒，制备多糖多肽注射液。或将多糖多肽溶液中再加入0.1‑1.0％(W/V)盐酸左旋咪唑，并用盐酸(作稳定剂)下调PH值1‑2(至PH4‑6.5)，溶解混匀，过滤，分装，消毒，制备左旋咪唑多糖多肽注射液。