[发明专利]一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法

权利要求书

1.一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)菌丝发酵物的制备：以液态深层发酵方法培养食药真菌菌丝, 25-30℃，100-180r/min培养2-4d，制备食药真菌菌丝发酵物，包括菌丝与发酵液, 所述食药真菌菌丝为松乳菇、金针菇、香菇、猴头菇或松茸；

(2)多糖多肽提取：取液体菌丝发酵物经研磨和高压均浆处理，使菌丝体破碎，加0.05-0.2％(w/v)的复合酶，进行第一次酶解，所述复合酶为纤维素酶和果胶酶的混合物，所述复合酶中纤维素酶：果胶酶为1.5:3，酶解条件为：pH为5，温度为50℃，时间为2-3h, 后80-90℃灭活10-20min；用木瓜蛋白酶第二次酶解，酶解条件为：pH为7.0，温度为50℃，时间为2-3h，用酶量32万U/100ml；后微波或超声波处理，微波时间为120S～180S，超声波条件为：超声波功率为400W，温度为50-60℃，时间为40-60min；再过滤，离心，离心条件为：转速为4000-5000rpm，时间为10-20min ,得多糖与多肽粗提取液；

(3)多糖多肽分离：粗提液减压浓缩，加乙醇至乙醇体积百分比浓度为70-75％，搅匀，静止沉淀过夜，使提取液中的多糖和多肽初步分离，得作为沉淀物的粗多糖和作为上清液的粗多肽；

(4)粗多糖多肽纯化：

1)粗多糖的纯化：将乙醇沉淀物水溶解，4号垂溶漏斗过滤后取滤液；加盐酸左旋咪唑使其体积百分比浓度为0.1-0.5％，煮沸15min，静置过夜，使蛋白与盐酸左旋咪唑结合沉淀，取上清液，280nm处测定无蛋白，离心；将上清液用碱调pH至7-8，按体积加入2-8％过氧化氢(w/v) ,于50-70℃脱色2-3h；加石油醚和氯仿分次脱脂、脱色和萃取残存左旋咪唑；超滤去除细菌和大分子物质；于60-80℃减压浓缩或纳滤膜过滤浓缩后进行冷冻干燥或真空干燥，或超滤后直接喷雾干燥，制得无菌纯化真菌多糖；

2)粗多肽的纯化：取乙醇沉淀的上清液低温减压回收乙醇，再用体积百分比浓度为80％、85％、90％、95％的乙醇依次沉淀，至无大分子蛋白和多糖的沉淀后，于50-70℃减压回收乙醇；用香草醛比色法或尼罗红染色法检测，如有脂肪存在，再经乙醇、丙酮、乙醚分步脱脂；配制成水溶液，加0.5-1.5％活性炭脱色，脱色条件为搅拌2h，静置10min，后超滤去除细菌和大分子物质；滤液经纳滤膜过滤浓缩或50-70℃减压浓缩后进行冷冻干燥或真空干燥；制得无菌纯化真菌多肽；

(5)复合免疫增强剂配伍制剂：

1)粉针制剂：将所得的无菌纯化真菌多糖、真菌多肽按质量比(2-5)：(1-5)配伍，无菌分装，制得药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强粉针剂；

或将所得的无菌纯化真菌多糖、真菌多肽按质量比(2-5)：(1-5)配伍，无菌分装，再按质量百分比加1-5％注射用盐酸左旋咪唑制备左旋咪唑多糖多肽粉针；

临用时用注射用水或生理盐水配制；

2)水针制剂：将纯化多糖多肽按质量比(2-5)：(1-5)取样，配制成10-30％(w/v)水溶液，超滤膜过滤，在无菌条件下分装于经高压消毒的药瓶内，巴氏消毒老化一体机中进行巴氏消毒，制备多糖多肽注射液；

或将多糖多肽注射液中再加入0.1-1.0％(w/v)盐酸左旋咪唑，并用盐酸作稳定剂，下调PH值1-2至pH为4-6.5，溶解混匀，过滤，分装，消毒，制备左旋咪唑多糖多肽注射液。

2.一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂,其特征在于,所述药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法如权利要求1所述。