[发明专利]人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法及其在制备诊断抗体试剂中的应用

摘要

人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法及其在制备诊断抗体试剂中的应用1）设计一对多肽多肽1Cys‑LDLETL‑T/V‑P(4‑hydroxy)‑YIPMDG‑NH2；多肽2Cys‑LDLETLAPYIPMDG‑NH2；2）多肽合成3)抗原制备；4）基础免疫和加强免疫；5）抗体纯化两步多肽层析柱亲和纯化；6）浓缩；7）抗体鉴定证明抗体只对同时有A530突变与P531羟基化特征的HIF2a有特异反应，对野生型HIF2a无反应。本发明含有特点位点突变和特定位点后修饰蛋白质的特异性抗体、制备及应用，能够实现人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的规模化生产。

主权项

一种人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法，其特征在于，步骤如下：1）多肽设计：设计一对多肽序列，分别为：多肽1：Cys‑LDLETL‑T/V‑P(4‑hydroxy)‑YIPMDG‑NH2；多肽2：Cys‑LDLETLAPYIPMDG‑NH2；2）多肽合成：多肽纯度≥70%；3) 抗原制备：将多肽1与KLH偶联，偶联物作为抗原用于免疫动物；KLH使用琥珀酰亚胺基4‑[N‑马来酰亚胺甲基]环己烷‑1‑羧化物双功能偶联剂预先活化成KLH‑SMCC，通过Cys与多肽1相联接；4）免疫：选用新西兰兔，每只兔子以300μg剂量进行基础免疫，以后每隔21天进行一次加强免疫，在经过三次加强免疫后，再经7天，取血样，对血清进行ELISA检测；收集经ELISA检测阳性的兔子血清；5）抗体纯化；6）浓缩：将纯化好的穿透液浓缩成特定浓度目标抗体浓液，通常1mg/ml以上；7）抗体鉴定：制备的目标抗体经间接酶联免疫法、斑点杂交法法、免疫印迹法鉴定，证明抗体只对同时有A530突变与P531羟基化特征的HIF2a有特异反应，对野生型HIF2a无反应。