[发明专利]人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法及其在制备诊断抗体试剂中的应用

说明书

技术领域

本发明专利涉及一种蛋白质的抗体制备及应用方法，具体涉及到一种人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体的制备方法及其在制备红细胞增多症及特定肿瘤诊断抗体试剂中的应用。

技术背景

缺氧诱导因子（HIFs）是一种转录因子，能控制细胞响应氧后产生的很多生物学功能，包括能量代谢以及特定红血细胞的生成、发育。其功能一旦失调，导致肿瘤形成、癌症发展及浸润。HIFs表达量的增加被发现在肿瘤细胞中存在，并以独特的方式调控肿瘤细胞能量的生成。

涉及控制细胞能量代谢过程有两条途径：一种是糖酵解途径，另一种是氧化磷酸化途径。当肿瘤细胞处于低氧的微环境时，低氧刺激细胞内的HIF大量表达，使胞内的氧化磷酸化途径受抑，而糖酵解途径增强（图1）。 而当处于氧充足的微环境下，HIFα亚基发生羟基化，羟基化的HIF与肿瘤抑制蛋白（VHL）结合，启动HIF泛素化降解，细胞主要能量经过氧化磷酸化途径（图2）。

HIFs能控制特定红血细胞的生成，红细胞增多引发红细胞增多症（polycythemia）。红细胞增多症以红细胞数目、血红蛋白、红细胞压积和血液总容量显著地超过正常水平为特点，可分为原发性与继发性两大类。原发性发病率与遗传因素关系较大，其中家族性良性红细胞增多症为常染色体遗传性疾病，有不同的外显性。继发性的主要是由组织缺氧所引起的。

科学家发现两例罕见的嗜铬细胞瘤和副神经节瘤患者的肿瘤细胞中的HIF2α发生了突变（Zhengping Zhuang etal., N Engl J Med. 2012 September 6; 367(10): 922–930）。科学家发现突变型HIF2a基因生成的蛋白相比于标准的基因形式的蛋白，其被降解代谢的速度明显减慢，导致其在细胞中稳定性与半寿期增加并在细胞中累积，从而导致红细胞生成增多。更具体讲，是由于HIF2a蛋白位点A530突变成T或V，导致了P531的羟基化异常，从而其代谢速度被减速（图3）。

科学家的实验证实了16例此类患者中，有11例发生了相同的突变，另2例发生了不同的但类似的突变。更多例不同原因的红细胞增多症患者的HIFs突变现象，以及在一些如白血病等癌症组织发生类似的突变现象，提示了HIFs的突变可能存在于多种类型癌症中，因此HIFs突变在多种癌症患者及不同的红细胞增多症的患者中具有普筛的意义。这些研究发现将帮助阐明一些癌症细胞的新陈代谢机制，有助于研究如何阻碍肿瘤生长等课题，为诊断与治疗肿瘤与红细胞过度生成相关的疾病提供了新方案。

基于人缺氧诱导因子HIF2a蛋白的重要功能，市场上已有人HIF2a的抗体产品。但是，这些产品测定的是普通人HIF2a蛋白水平，具体讲，这些产品只能测定人HIF2a蛋白的总量，或只能对人HIF2a蛋白存在性做定性分析。因无法对A530突变及P531羟基化后修饰的人HIF2a做定性与定量分析，故无法应用于由此机制引发的红细胞增多症患者及肿瘤病变类型的诊断。

发明内容

本发明的目的是提供一种人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体的制备方法。本发明还将提供人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体在制备由人HIF2a蛋白经A530突变与P531羟基化引起的红细胞增多症及肿瘤类型的诊断抗体试剂中的应用方法。本发明能够克服现有技术中的HIF2a抗体产品只能测定人HIF2a蛋白的总量，或只能对人HIF2a蛋白存在性做定性分析，无法对A530突变及P531羟基化后修饰的人HIF2a做定性与定量分析等不足。本发明制备的抗体，可以针对性识别特定位点A530突变后且引发P531羟基化后修饰人HIF2a蛋白，故能针对性应用于由此机制引发的红细胞增多症患者及肿瘤病变类型的诊断。

完成上述发明任务的技术方案是，一种人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1）多肽设计：设计一对多肽序列，分别为：

多肽1：Cys-LDLETL-T/V-P(4-hydroxy)-YIPMDG-NH2；

多肽2：Cys-LDLETLAPYIPMDG-NH2；

说明:

a.两条多肽序列均为14aa肽，对应人类HIF2a蛋白位置为aa524-537。人类HIF2a蛋白信息如图4所示。实际应用中，多肽序列在长度上可以小范围缩小或增加。