[发明专利]人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法及其在制备诊断抗体试剂中的应用

权利要求书

1.一种人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1）多肽设计：设计一对多肽序列，分别为：

多肽1：Cys-LDLETL-T/V-P(4-hydroxy)-YIPMDG-NH2；

多肽2：Cys-LDLETLAPYIPMDG-NH2；

2）多肽合成：多肽纯度≥70%；

3) 抗原制备：将多肽1与KLH偶联，偶联物作为抗原用于免疫动物；KLH使用琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物双功能偶联剂预先活化成KLH-SMCC，通过Cys与多肽1相联接；

4）免疫：选用新西兰兔，每只兔子以300μg剂量进行基础免疫，以后每隔21天进行一次加强免疫，在经过三次加强免疫后，再经7天，取血样，对血清进行ELISA检测；收集经ELISA检测阳性的兔子血清；

5）抗体纯化；

6）浓缩：将纯化好的穿透液浓缩成特定浓度目标抗体浓液，通常1mg/ml以上；

7）抗体鉴定：制备的目标抗体经间接酶联免疫法、斑点杂交法法、免疫印迹法鉴定，证明抗体只对同时有A530突变与P531羟基化特征的HIF2a有特异反应，对野生型HIF2a无反应。

2.根据权利要求1所述的人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法，其特征在于，步骤1）所述的两条多肽有以下特征：

a.两条多肽序列均为14aa肽，对应人类HIF2a蛋白位置为aa524-537；

b.多肽序列在N端人为添加一个半胱氨酸用于抗原偶联；或将Cys添加在多肽C端；

c.多肽1中，T/V为混合苏氨酸和缬氨酸，两者各占50%，对应HIF2a A530位点突变类型A530T或A530V；P(4-hydroxy)为4-羟基化脯氨酸，对应HIF2a P531 4-羟基化；多肽2为正常野生型多肽；G-NH2为末端酰胺化的甘氨酸；或者，G-NH2末端氨基酸不加修饰。

3.根据权利要求1所述的人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法，其特征在于，步骤2）所述的多肽纯度≥85%。

4.根据权利要求1所述的人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法，其特征在于，步骤5）所述抗体纯化的具体操作如下：

a. 制备一对亲和层析柱：多肽与胶的剂量按2mg：2mg，将多肽1与多肽2分别通过Cys偶联在预先活化好的巯基琼脂糖凝胶上，制备一对亲和层析柱；

b. 纯化：血清按10：1体积比例加入1 M Tris·HCl pH7.5 缓冲液调节pH值，再用0.45μm膜过滤；处理过血清再与多肽1偶联的层析柱室温下混匀反应2小时；用10mM PBS pH7.4清洗层析柱后，再用100 mM 甘氨酸pH2.8缓冲液洗脱，收集OD280≥0.2部分洗脱液；收集液立即用 1M Tris·HCl pH7.5缓冲液调节pH；再将收集液与多肽2偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤重复1到3次，直至穿透液被多肽2抗原吸收完全；穿透液即含有纯化目标抗体。

5.根据权利要求1-4之一所述的人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法，其特征在于，步骤7）所述抗体鉴定的检测方法如下：

a. 间接酶联免疫法：将多肽1与多肽2分别偶联BSA，偶联物作为检测抗原，以5μg/ml，每孔100μl包被96孔板；经间接ELISA检测，证明目标抗体1：1000倍稀释后，对多肽1的反应数值大于多肽2的反应数值10倍以上，目标抗体对多肽1有极强反应，对多肽2反应极弱可怱略；

b．斑点杂交法：采用多肽1与多肽2与BSA的偶联物作为检测抗原；经Dot-Blot法检测，证明目标抗体只对多肽1有特异反应，对多肽2无反应；

c. 免疫印迹法：采用转染A530V突变型HIF2a基因的人A549细胞与正常野生型人A549细胞的裂解液经免疫印迹法检测，证明目标抗体只对A530V突变型HIF2a蛋白有反应，与野生型HIF2a蛋白无反应。

6.权利要求1所述的特异性抗体在制备红细胞增多症及肿瘤诊断抗体试剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的特异性抗体在制备红细胞增多症及肿瘤诊断抗体试剂中的应用，其特征在于，所述的应用为以下方法之一：

A 夹心酶联免疫法，

所述人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体，再选取HIF2a普通抗体进行配对，形成一对夹心ELISA抗体；对红细胞增多症及肿瘤抗相关细胞或组织的裂解液，以及细胞培养物，患者血样等样品进行夹心ELISA检测；

B 免疫印迹法，

所述人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体，对红细胞增多症及肿瘤抗相关细胞或组织的裂解液，重组蛋白等样品进行免疫印迹法检测；

C 免疫组化法，

所述人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体，对红细胞增多症及肿瘤抗相关细胞或组织进行免疫组化法检测；

D 免疫沉淀法，

所述人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体，对红细胞增多症及肿瘤抗相关细胞或组织，患者血样进行免疫沉淀法检测；

E 免疫荧光法，

所述人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体，通过直接荧光标记，或通过荧光标记二抗法，对红细胞增多症及肿瘤抗相关细胞或组织，患者血样进行免疫荧光法检测；

F 流式细胞术，

所述人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体，通过流式细胞术，对红细胞增多症及肿瘤抗相关细胞或组织，患者血样进行检测。