[发明专利]一种κ‑卡拉胶寡糖单体快速分离纯化的方法

摘要

本发明公开了一种κ‑卡拉胶寡糖单体快速分离纯化的方法，属于海藻低聚糖提取分离技术领域。具体步骤如下1）κ‑卡拉胶寡糖的酶解制备采用生物酶解法降解κ‑卡拉胶底物溶液，反应液恒温水浴酶解48 h，加热终止反应，冷却至室温后离心去除未酶解的不溶性片段，上清液采用切向超滤，收集小于3kDa的组分，冷冻干燥得寡糖混合物干粉；2）采用闪式中低压制备色谱快速分离纯化寡糖单体；3）根据分析检测，获得四种κ‑卡拉胶寡糖单体，一个循环耗时仅1.5 h，寡糖总量得率为5%。本发明操作方便，同时制备量大，上样浓度可达克级别，纯度高，分离耗时短，工艺过程稳定重现性高，所用预备柱及仪器可重复使用，可实现规模化生产。

主权项

一种κ‑卡拉胶寡糖单体快速分离纯化的方法，其特征在于，具体步骤如下：1）κ‑卡拉胶寡糖的酶解制备：用去离子水配制质量浓度为0.2%~0.5％的κ‑卡拉胶底物溶液，往溶液中加入用量为反应总体积的5%~10％的κ‑卡拉胶酶液，于45℃恒温水浴反应48 h，加热煮沸5 min终止反应，冷却至室温，水解液于10000r/min离心10 min以去除未酶解的不溶性片段；2）收集离心上清液，依次过10kDa、3kDa切向超滤膜，收集分子量小于3kDa的酶解液，采用Sevag法去除上清液中的蛋白和脂类，再次离心取上清液旋蒸浓缩、冷冻干燥，获得κ‑卡拉胶寡糖固体混合物；3）将κ‑卡拉胶寡糖固体混合物配制成κ‑卡拉胶寡糖溶液，采用中低压制备色谱系统分离纯化寡糖单体，分离纯化条件为：等度洗脱，柱温：25℃，上样浓度0.3~1.2 g/mL，上样体积为0.5~3 mL，洗脱液为0.1M NH4HCO3，洗脱流速为1~4 mL/min；4）合并组分一致的溶液，旋蒸浓缩，冷冻干燥，采用TLC及ESI‑MS检测，得到聚合度不同的κ‑卡拉胶寡糖单体。