[发明专利]一种κ‑卡拉胶寡糖单体快速分离纯化的方法

说明书

技术领域

本发明属于海藻低聚糖提取分离技术领域，涉及一种κ-卡拉胶寡糖单体快速分离纯化的方法。

背景技术

卡拉胶寡糖与其他硫酸低聚糖及其衍生物类似，具有多种生物学活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗氧化及调节免疫等。其功能活性与卡拉胶寡糖的聚合度、硫酸基团的取代数量及取代位置有关，已引起了科研工作者的关注，成为食品、医药等领域开发和研究的热点。牟海津等采用酶解法获得不同聚合的新型κ-卡拉胶低聚糖，并采用磺化修饰获得其衍生物，样品能明显抑制小鼠S180肉瘤活性，结果表明其抗肿瘤效果随着硫酸基团的增多而降低，因此卡拉胶低聚糖的抗肿瘤效果与硫酸基团的含量有着密切联系。Wei Wang等研究发现，低分子量的卡拉胶低聚糖及其硫酸化衍生物可有效地抑制MDCK细胞中甲型流感病毒（IVA）的生长，同时抗病毒活性最佳的为分子量在1~3kDa、硫酸含量在0.8~1.0mole/mole之间的低聚糖片段，进一步阐明了卡拉胶低聚糖的抗病毒活性与其分子量与硫酸基团含量有密切的关系。除此之外，Wei Wang等进一步验证了κ-卡拉胶寡糖抗H1NI病毒的活性与其分子量有密切关系，即2kDa＞3kDa＞5kDa。Ling Xu等、Zi-ang Yao等研究了κ-卡拉胶寡糖对LPS诱导的小胶质细胞的免疫调节活性，结果表明κ-卡拉胶寡糖及脱硫κ-卡拉胶寡糖能抑制LPS诱导的小胶质炎症细胞的活性，并且呈剂量依赖关系，同时，脱硫κ-卡拉胶寡糖的抗炎效果弱于κ-卡拉胶寡糖。

目前，寡糖分离方法很多，传统的有分步沉淀法、盐析法、超滤、凝胶柱层析、离子交换等，近来发展起来的有高效液相色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、电印迹、离子色谱等新方法。近年来，科研工作者已采用了乙醇分步沉淀法、凝胶过滤层析法（a Bio-Gel P-2 column、a Bio-gel P6 column、Q-Sepharose Fast Flow）、高效凝胶渗透色谱法（PL aquagel-OH column）、体积排阻色谱法（SEC）、高效液相系统（Superdex peptide 10/300 GL column）、离子对液相色谱法（Spherisorb ODS1 column）、AKTA快速蛋白液相色谱（Superdex 30 colunm）等对卡拉胶寡糖进行分离纯化。但都因其效率低，制备量小，限制了其工业化应用。其中凝胶柱Superdex 30 colunm及Bio-gel为两种最常用的填料，因其较好的灵敏度和分辨率，对于低分子量寡糖，具有较好的分离效果。但由于这些制备柱多被高效液相系统等色谱系统联用，虽然可在线监测，但其制备量及工作效率，大大影响了其规模化应用。

闪式制备色谱技术，根据所施加的压力，可以分为快速色谱(0.1-5/10 bars)或中压液相色谱MPLC (5/10-50 bars)。闪式色谱系统最初用于快速纯化合成化合物的应用，很少见到将这种系统应用在复杂天然产物提取所得混合物的分离中。相比于高效液相色谱和高速逆流色谱法，其制备量大，样品上样量可从毫克级到百克不等，试验时间较短，同时分离柱填料能够自主填充，增加了分离选择性，有效地节约了试验生产成本，在天然产物的分离纯化研究工作中发挥着重要作用。同时，一般配置的制备色谱只有紫外检测器，这并不适用于没有紫外吸收峰的化合物检测，如碳水化合物等；而采用苯酚-硫酸法等离线检测，常需使用有害的化学试剂，且特异性差，分析时间较长，样品浪费也较为严重。卢旭等人，已采用中低压制备色谱系统对莲子低聚糖进行理想的分离纯化，并且上样量较大，得率较高，效果显著。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种κ-卡拉胶寡糖单体快速分离纯化的制备方法。以Rs分辨率为评价指标，通过优化上样浓度、上样体积、洗脱流速等，确定最佳分离纯化工艺，以期为κ-卡拉胶寡糖单体规模化制备奠定基础；该方法操作方便，同时制备量大，上样浓度可达克级别，纯度高，分离耗时短，工艺过程稳定重现性高，所用预备柱及仪器可重复使用，可实现规模化生产。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案在于：

一种κ-卡拉胶寡糖单体快速分离纯化的方法，具体步骤如下：

1）κ-卡拉胶寡糖的酶解制备：用去离子水配制质量浓度为0.2%~0.5％的κ-卡拉胶底物溶液，往溶液中加入用量为反应总体积的5%~10％的κ-卡拉胶酶液，于45℃恒温水浴反应48 h，加热煮沸5 min终止反应，冷却至室温，水解液于10000r/min离心10 min以去除未酶解的不溶性片段；