[发明专利]一种κ‑卡拉胶寡糖单体快速分离纯化的方法

权利要求书

1.一种κ-卡拉胶寡糖单体快速分离纯化的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）κ-卡拉胶寡糖的酶解制备：用去离子水配制质量浓度为0.2%~0.5％的κ-卡拉胶底物溶液，往溶液中加入用量为反应总体积的5%~10％的κ-卡拉胶酶液，于45℃恒温水浴反应48 h，加热煮沸5 min终止反应，冷却至室温，水解液于10000r/min离心10 min以去除未酶解的不溶性片段；

2）收集离心上清液，依次过10kDa、3kDa切向超滤膜，收集分子量小于3kDa的酶解液，采用Sevag法去除上清液中的蛋白和脂类，再次离心取上清液旋蒸浓缩、冷冻干燥，获得κ-卡拉胶寡糖固体混合物；

3）将κ-卡拉胶寡糖固体混合物配制成κ-卡拉胶寡糖溶液，采用中低压制备色谱系统分离纯化寡糖单体，分离纯化条件为：等度洗脱，柱温：25℃，上样浓度0.3~1.2 g/mL，上样体积为0.5~3 mL，洗脱液为0.1M NH₄HCO₃，洗脱流速为1~4 mL/min；

4）合并组分一致的溶液，旋蒸浓缩，冷冻干燥，采用TLC及ESI-MS检测，得到聚合度不同的κ-卡拉胶寡糖单体。

2.根据权利要求1所述的κ-卡拉胶寡糖单体快速分离纯化的方法，其特征在于：所述κ-卡拉胶酶液的制备方法如下：将海旋菌（Thalassospira sp）fjfst-332菌株于斜面培养基活化 24 h 后，接种至液体种子培养基，接种量为3ml/25ml，在25℃、125 r/min 震荡培养 12 h后，得到种子培养液；将培养液接种至发酵培养基中，接种量为3ml/25ml，在25℃、125 r/min震荡培养 36 h，将发酵液以8000 r/min转速离心20min，除去培养基中的颗粒性杂质和菌体细胞，收集上清液，分别过50kD和10kD的超滤膜，收集浓缩酶液即为κ-卡拉胶酶液。

3.根据权利要求1所述的κ-卡拉胶寡糖单体快速分离纯化的方法，其特征在于：步骤3）中，中低压制备色谱系统分离纯化寡糖单体的条件为：上样浓度为1.2 g/mL，上样体积为1 mL，洗脱流速为4 mL/min。

4.根据权利要求1所述的κ-卡拉胶寡糖单体快速分离纯化的方法，其特征在于：步骤3）中，每次进样使用3个柱体积的初始梯度流动相平衡色谱柱，每次分离纯化完成后，流动相拉回原梯度冲洗一个柱体积，然后再次准备下次进样。

5.根据权利要求1所述的κ-卡拉胶寡糖单体快速分离纯化的方法，其特征在于：步骤3）所述的中低压制备色谱系统采用DAD紫外全波长扫描器与FLASH ELSD蒸发光散射检测器联合使用，系统的控制和数据采集采用Interchim Software 5.0软件操作。

6.根据权利要求5所述的κ-卡拉胶寡糖单体快速分离纯化的方法，其特征在于：紫外全波长扫描器波长范围：190-840 nm，蒸发光散射检测器参数设置：吹扫氮气压力为3.4 bar，漂移管温度100 ℃。