[发明专利]一种高效扩增NKT细胞的方法

摘要

本发明涉及细胞培养技术领域，本发明的培养方法培养的NKT细胞纯度较高，数量大。本发明主要通过联合使用α‑半乳糖神经酰胺(glycolipid α‑galactosylceramide，α‑GalCer)、利拉鲁肽(GLP‑1)、IL‑2、CD3单抗、CS1单抗及IL‑21来实现NKT的大量扩增。本发明对具体的培养方法也进行描述，包含抗体的包被、NKT细胞的活化及NKT的扩增。本发明简化了流程，最大程度的避免了污染；同时培养的NKT细胞纯度高，周期短，并且获得的NKT具有较高的杀伤活性。

主权项

1.一种NKT细胞培养组合物及其培养方法，其特征在于首先使用α‑GalCer、利拉鲁肽(GLP‑1)、CD3及CS1对NKT进行活化。活化后再进行扩增培养。主要包括以下几个步骤：(1)抗体包被用PBS稀释CD3及CS1单抗，并用稀释好的单抗包被T75培养瓶，CD3、CS1单抗包被浓度分别为0.1‑0.5μg/mL、10‑60μg/mL.然后置于4℃孵育过夜或者37℃培养箱中孵育2h。(2)PBMC分离及自体血清制备使用Ficoll分离外周血中的PBMC，并使用X‑VIVO培养基将PBMC的浓度调整至约1×106个/mL。同时将分离得到的血浆于56℃进行灭活30min。然后离心后取上清，于4℃储存备用。(3)NKT细胞活化培养将分离后的细胞转移至包被并用PBS清洗过的培养瓶中。然后加入IL‑2、α‑GalCer、GLP‑1它们的终浓度约为500‑800IU/mL、60‑120ng及10‑30ng/mL。最后加入7‑10％的自体血清。(4)NKT细胞的扩增培养观察细胞状态，当观察到细胞的克隆团较多且较大时，将其转入新的培养瓶中，并补加已经添加IL‑2及IL‑21的X‑VIVO培养基，IL‑2及IL‑21的终浓度分别为300‑600IU/mL和10‑80ng/mL。随后进行隔天补液。使细胞浓度维持在1X106。在培养第14天后，收集的细胞即为NKT细胞。