[发明专利]一种高效扩增NKT细胞的方法

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，本发明的培养方法培养的NKT细胞纯度较高，数量大。本发明主要通过联合使用α‑半乳糖神经酰胺(glycolipid α‑galactosylceramide，α‑GalCer)、利拉鲁肽(GLP‑1)、IL‑2、CD3单抗、CS1单抗及IL‑21来实现NKT的大量扩增。本发明对具体的培养方法也进行描述，包含抗体的包被、NKT细胞的活化及NKT的扩增。本发明简化了流程，最大程度的避免了污染；同时培养的NKT细胞纯度高，周期短，并且获得的NKT具有较高的杀伤活性。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种NKT细胞培养组合物及其培养方法。

背景技术

自然杀伤T细胞(Nature KillerT，NKT)，是继T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞之外的第四类淋巴细胞。NKT细胞发现于1986年，NKT细胞具有T细胞和NK细胞两重性质，既能表达Va14/Ja281特定的T细胞受体又能由CD1介导识别脂质抗原。

研究显示NKT细胞在人体内发挥着细胞毒作用，NKT细胞活化后具有NK细胞样细胞毒活性，可溶解NK细胞敏感的靶细胞，主要效应分子为穿孔素，Fas配体以及IFN-γ。同时NKT在人体内还发挥着免疫调节的作用。NKT细胞受到刺激后，可以分泌大量的IL-4，IFN-γ，GM-CSF，IL-13和其它细胞因子和趋化因子，发挥免疫调节作用，它是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁之一。研究显示它可以通过调节Th1/Th2型T淋巴细胞间的平衡而发挥免疫调节作用，NKT细胞的减少是这些免疫系统疾病的主要致病原因。因此NKT细胞作为一类新型的免疫调节细胞在抗感染、肿瘤免疫、器官免疫排斥和抑制自身免疫性疾病发生中均具有重要功能。

近年来，研究发现NKT细胞在对抗肥胖和代谢综合征(肥胖的一个严重后果)方面具有保护性的作用。它可以协助脂肪细胞表达成纤维细胞生长因子-21，FGF-21可以触发人体进行代谢，将白色脂肪转化为更加健康的棕色脂肪。在这个白色脂肪棕色化的过程中消耗大量能量，从而导致增加的代谢率和体重减轻。由此可见，NKT在加强体重减轻的事件中发挥着关键性作用。

过继免疫治疗已经成为肿瘤免疫治疗的主要方式之一，它主要包括特异性的TIL、TCR、CAR-T、CAR-NK和非特异性的CIK、DC、NK、NKT等。正是由于以上NKT其独特的特点，其在肿瘤免疫治疗中的应用越来越受到重视。同时NKT在免疫调节及对抗肥胖方面的功能也越来越得到重视。NKT细胞不仅广泛用于癌症病人治疗，还可应用于亚健康人群。因此，如何获得大量的NKT细胞成为目前亟待解决的问题。

目前，NKT细胞的大量获得仍然主要是通过采用磁珠分选或流式分选后进行扩增培养的。但是磁珠分选及流式分选操作繁琐，无疑增加了细胞污染的风险，并且成本也较高。因此，研发一种低风险，低成本的NKT细胞培养方法称为一个亟待解决的问题。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种无需通过流式分选或磁珠分选，就可以获得纯度较高的NKT细胞，简化了操作流程且大大降低了成本。

本发明所采用的技术方案是：

对从外周血中分离PBMC细胞进行活化，活化后再进行扩增培养。主要包括以下几个步骤：

(1)抗体包被

用PBS稀释CD3及CS1单抗，并用稀释好的单抗包被T75培养瓶，CD3、CS1单抗包被浓度分别为0.1-0.5μg/mL、10-60μg/mL.然后置于4℃孵育过夜或者37℃培养箱中孵育2h。

(2)PBMC分离及自体血清制备

使用Ficoll分离外周血中的PBMC，并使用X-VIVO培养基将PBMC的浓度调整至约1×10⁶个/mL。同时将分离得到的血浆于56℃进行灭活30min。然后离心后取上清并于4℃储存备用。

(3)NKT细胞活化培养