[发明专利]一种气-液界面暴露系统联合高内涵技术定量检测1;3-丁二烯致细胞DNA损伤的方法

摘要

本发明公开了一种气‑液界面暴露系统联合高内涵技术定量检测1,3‑丁二烯致细胞DNA损伤的方法，所示方法包括以下步骤：1)细胞培养，2)通过气‑液界面暴露方式的1,3‑丁二烯染毒，3)γH2AX的免疫荧光标记，4)高内涵检测。本发明的优点在于：采用体外气‑液界面暴露方式实现了气态1,3‑丁二烯在体外对贴壁细胞的高效染毒，提高了1,3‑丁二烯的染毒效率；利用高内涵成像系统自动成像，定量分析1,3‑丁二烯诱导产生的DNA双链断裂标志物γH2AX蛋白质，实现了细胞的直接、快速检测，使得样本处理更为方便；高分辨率的成像，不仅使γH2AX在细胞核内的分布可直接观测而且使图像资料便于存储和再分析，并且可以实现对1,3‑丁二烯在每个细胞核内诱导的γH2AX进行定量分析，检测结果更为灵敏和准确。

主权项

1.一种气‑液界面暴露系统联合高内涵技术定量检测1,3‑丁二烯致细胞DNA损伤的方法，所述方法包括以下步骤：1)细胞培养：将处于对数生长期的贴壁生长细胞以单细胞悬液接种在底部为渗透性滤膜的装置中，然后将所述装置在细胞培养液中进行细胞培养，使细胞在渗透性滤膜上单层生长；2)细胞染毒：移除所述装置中的细胞培养液，取出装置并置于包含细胞染毒液和毒性气体的染毒仓中，使得装置中的渗透性滤膜底部与细胞染毒液接触，同时渗透性滤膜上的细胞表面暴露于毒性气体达1h，其中所述细胞染毒液与步骤1)中的细胞培养液相同，并且其中所述毒性气体由空气与1,3‑丁二烯组成且其中1,3‑丁二烯的浓度为>0且≤43.98mmoL/L，所述毒性气体的流量为20mL/min；3)免疫荧光标记：3‑1)从染毒仓中取出所述装置，洗涤，然后置于托盘内，向装置内的细胞中加入多聚甲醛进行细胞固定；3‑2)洗涤所述装置和托盘，然后向装置内的细胞中加入TritonX‑100以使细胞通透；3‑3)洗涤所述装置和托盘，然后向装置内的细胞中加入血清白蛋白封闭，之后加入一抗即抗γH2AX抗体进行孵育；3‑4)洗涤所述装置和托盘，然后向装置内的细胞中加入免疫荧光标记的二抗进行孵育；3‑5)洗涤所述装置和托盘，然后向装置内的细胞中加入DAPI进行染色；3‑6)洗涤所述装置和托盘，保存；4)高内涵技术定量检测：分别进行所述细胞的细胞核和γH2AX的荧光测定，以所识别的有效细胞的有效细胞核内检测到的平均荧光强度来表征γH2AX的含量。