[发明专利]一种气-液界面暴露系统联合高内涵技术定量检测1;3-丁二烯致细胞DNA损伤的方法

权利要求书

1.一种气-液界面暴露系统联合高内涵技术定量检测1,3-丁二烯致细胞DNA损伤的方法，所述方法包括以下步骤：

1)细胞培养：将处于对数生长期的贴壁生长细胞以单细胞悬液接种在底部为渗透性滤膜的装置中，然后将所述装置在细胞培养液中进行细胞培养，使细胞在渗透性滤膜上单层生长；

2)细胞染毒：移除所述装置中的细胞培养液，取出装置并置于包含细胞染毒液和毒性气体的染毒仓中，使得装置中的渗透性滤膜底部与细胞染毒液接触，同时渗透性滤膜上的细胞表面暴露于毒性气体达1h，其中所述细胞染毒液与步骤1)中的细胞培养液相同，并且其中所述毒性气体由空气与1,3-丁二烯组成且其中1,3-丁二烯的浓度为>0且≤43.98mmoL/L，所述毒性气体的流量为20mL/min；

3)免疫荧光标记：

3-1)从染毒仓中取出所述装置，洗涤，然后置于托盘内，向装置内的细胞中加入多聚甲醛进行细胞固定；

3-2)洗涤所述装置和托盘，然后向装置内的细胞中加入TritonX-100以使细胞通透；

3-3)洗涤所述装置和托盘，然后向装置内的细胞中加入血清白蛋白封闭，之后加入一抗即抗γH2AX抗体进行孵育；

3-4)洗涤所述装置和托盘，然后向装置内的细胞中加入免疫荧光标记的二抗进行孵育；

3-5)洗涤所述装置和托盘，然后向装置内的细胞中加入DAPI进行染色；

3-6)洗涤所述装置和托盘，保存；

4)高内涵技术定量检测：分别进行所述细胞的细胞核和γH2AX的荧光测定，以所识别的有效细胞的有效细胞核内检测到的平均荧光强度来表征γH2AX的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述细胞以单细胞悬液接种于底部为渗透性滤膜的装置中，然后在细胞培养液中于37℃，5％CO₂条件下培养24h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述渗透性滤膜为涤纶膜，膜上小孔的孔径为0.4μm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，在细胞接种之前，用细胞培养液或PBS将所述装置在37℃下平衡1-2h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述毒性气体中1,3-丁二烯的浓度为8.80-43.98mmoL/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，所述细胞的细胞核和γH2AX的荧光测定分别在两组不同的激发波长和发射波长下进行；其中，所述步骤3-4)中，免疫荧光标记的二抗为Alexa Fluor 488标记的二抗，并且所述步骤4)中，在通道一中以激发波长358nm和发射波长461nm进行细胞核的荧光测定，在通道二中以激发波长495nm和发射波长519nm进行γH2AX的荧光测定，以获得通道一所识别的有效细胞的有效细胞核内通道二所检测的平均荧光强度，由此表征γH2AX的含量。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在两个通道中，测量倍数为100倍，每孔分析和测定9个视野。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，设置在步骤3-3)中没有加入一抗、仅在步骤3-4)中加入二抗的空白对照组，从而在步骤4)中得到由非特异吸附引起的空白信号，由此从检测到的荧光测定信号中扣除空白信号。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，通过在步骤2)中设置多种包含不同浓度的1,3-丁二烯的毒性气体，进行所述方法，最后根据步骤4)获得的γH2AX平均荧光强度和1,3-丁二烯的浓度绘制剂量-效应曲线。

10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，通过在步骤2)中使细胞在染毒仓中接触包含相同浓度的1,3-丁二烯的毒性气体达不同时间，进行所述方法，最后根据步骤4)获得的γH2AX平均荧光强度和接触毒性气体的时间绘制时间-效应曲线。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述毒性气体经过0.2μm滤膜过滤后进入所述染毒仓内。