[发明专利]一种气-液界面暴露系统联合高内涵技术定量检测1;3-丁二烯致细胞DNA损伤的方法

说明书

本发明公开了一种气‑液界面暴露系统联合高内涵技术定量检测1,3‑丁二烯致细胞DNA损伤的方法，所示方法包括以下步骤：1)细胞培养，2)通过气‑液界面暴露方式的1,3‑丁二烯染毒，3)γH2AX的免疫荧光标记，4)高内涵检测。本发明的优点在于：采用体外气‑液界面暴露方式实现了气态1,3‑丁二烯在体外对贴壁细胞的高效染毒，提高了1,3‑丁二烯的染毒效率；利用高内涵成像系统自动成像，定量分析1,3‑丁二烯诱导产生的DNA双链断裂标志物γH2AX蛋白质，实现了细胞的直接、快速检测，使得样本处理更为方便；高分辨率的成像，不仅使γH2AX在细胞核内的分布可直接观测而且使图像资料便于存储和再分析，并且可以实现对1,3‑丁二烯在每个细胞核内诱导的γH2AX进行定量分析，检测结果更为灵敏和准确。

技术领域

本发明属于体外遗传毒性测定技术领域，更具体而言，本发明涉及1,3-丁二烯的遗传毒性测定方法。

背景技术

1,3-丁二烯是一种常见的大气和环境污染物，可以通过吸入途径诱导多器官肿瘤。此外，1,3-丁二烯环氧代谢产物可以形成DNA加合物，诱导Hprt(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶)基因突变等。目前世界卫生组织(WHO)下属的国际癌症研究组织(IARC)已经将1,3-丁二烯列为1类致癌物，同时世界卫生组织烟草控制框架公约(FCTC)将1,3-丁二烯列为烟气优先级管制污染物之一。因此，准确检测1,3-丁二烯气体对细胞DNA的损伤，对于1,3-丁二烯遗传毒性和危害性评价具有较为重要的意义。

DNA双链断裂是DNA最严重的一种损伤形式，如果这种损伤不能被正确或者及时修复就可能会导致染色体畸变或者细胞凋亡等。作为DNA双链断裂的一种生物标志物，磷酸化组蛋白γH2AX已经被广泛地应用于临床医药学、放射学及毒理学等研究方面。包括很多单体化合物和混合物通过γH2AX实验对其遗传毒性进行了测定和评价。例如，Tanaka等利用γH2AX实验对卷烟烟气冷凝物的遗传毒性进行了检测和评价；Smart等采用γH2AX实验对依托泊苷、米托蒽醌及甲基亚硝脲的DNA双链断裂的剂量-效应关系进行了研究，并且通过已知的不同类型遗传毒性化合物对该实验进行了评价。该实验因其灵敏性高、结合其他仪器检测技术可以进行大规模分析检测，拥有其他遗传毒性检测技术并不具备的多种优点，目前已经被广泛地应用于化合物和有毒物质的遗传毒性筛选和评价。

目前对γH2AX进行分析检测的主要方法有流式细胞仪、ELISA(酶联免疫吸附试验)、Western Blot(蛋白质印迹)、显微镜技术等。流式细胞仪和Western Blot操作繁琐，检测前需要将贴壁细胞酶解成单细胞悬液，破坏了细胞的结构和功能完整性，且检测通量较低。ELISA不能提供细胞内荧光焦点的分布情况且需要额外添加其他检测蛋白对结果进行校正，而显微镜技术的检测通量低，且人为计数的误差较大。

由于技术和条件的限制，传统上对于气态类物质的暴露和毒性检测通常将气态物质溶解于液体中，从而实现细胞和气体的接触暴露，即气-液混合暴露方式。这种暴露方式虽然对于很多物质有用，但并不是经常有效。这是因为有些气体溶解于液体(通常是水)中的溶解度有限，从而限制了暴露浓度的上限；第二，有些气态物质能和水发生反应，从而间接改变了检测目的；第三，气-液混合暴露虽然对于悬浮细胞来说能使溶解于液体基质中的气体与细胞充分接触，但是对于贴壁培养的细胞很难实现充分接触。

气-液界面暴露系统的发展极大地避免了传统的气-液混合暴露方式存在的问题，极大地提高了贴壁细胞体外暴露的有效性。因此，气-液界面系统目前已经被广泛用来研究挥发性物质或者气溶胶类物质的暴露。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种无需破坏细胞、简单、有效且灵敏度高的1,3-丁二烯DNA损伤的定量检测方法，该方法可以采用直接的气体暴露方式进行，检测结果准确并且可视化，以克服现有技术的缺陷。

本发明的目的通过将气-液界面暴露技术和高内涵检测γH2AX技术相结合而实现。具体而言，本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：