[发明专利]一种HPLC结合UPLC-MS检测PQQ对乳酸作用的方法

摘要

一种HPLC结合UPLC‑MS检测PQQ对乳酸作用的方法，属于生物分析技术领域。本发明采用UPLC方法研究了PQQ与乳酸的反应，优化了分离条件，使PQQ与多个反应产物达到分离。并采用UPLC‑MS对其反应产物进行了定性分析。本发明首次研究PQQ与乳酸的反应行为，在反应液中发现了3种产物，其准分子离子【M+H】⁺分别为403，475及547。PQQ分别与一分子乳酸、二分子乳酸、三分子乳酸发生酯化反应得产物PQQLa1、PQQLa2及PQQLa3。通过不同反应时间各生成物的峰面积发现主要以PQQLa1存在，酯化后的产物透过血脑屏障进入细胞外液，由此降低了细胞外液乳酸的含量。对研究PQQ在神经保护作用机制，尤其与衰老有关的疾病研究方面具有极为重要的研究价值。

主权项

1.一种HPLC结合UPLC‑MS检测PQQ对乳酸作用的方法，其特征在于步骤为：（1）UPLC分析条件ACQUiTY UPLC@ BEH C18 column 2.1×100mm,1.7μm，流动相A：H2O+0.2%TFA，B：甲醇；5/95 B/A洗脱5min，20 min梯度洗脱至75/25 B/A；检测波长322nm；（2）波长的确定称取一定量的PQQ及乳酸，分别用0.1M盐酸溶液溶解，配制成1mM 的PQQ溶液及1mM 的乳酸溶液，按v/v为1︰5混合，避光，于37℃水浴孵育24h，冰浴终止反应；紫外扫描图显示322nm紫外吸收较高；选择322nm 作为检测波长；（3）流动相组分对分离的影响在流动相中分别添加三氟乙酸TFA质量百分比为：0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.3 %TFA试验，当TFA含量为0.2%时，流动相A：H2O+0.2%TFA，B：甲醇；5/95 B/A洗脱5min，20 min梯度洗脱至75/25 B/A；各组份峰型对称性较好，PQQ与3种生成物都能达到基线分离；（4）UPLC‑MS 对PQQ与乳酸的反应产物的定性分析采用ACQUiTY UPLC@ BEH C18 column 2.1×100mm,1.7μm，质谱检测器SQ Detector 2及PDA检测器，优化质谱参数：脱溶剂气温度：400℃；脱溶剂气流量：600 L/h；离子源温度：110℃；锥孔气流量：50L/h；毛细管电压：3000 V；锥孔电压：30V；质谱采用电喷雾正离子模式ESI+，质量扫描范围为m/z 50～800；流动相A：H2O+0.2%TFA，B：甲醇；5/95 B/A洗脱5min，20min梯度洗脱至75/25 B/A；进样10μL，反应液的ESI‑MS谱图中，主要离子为m/z 403, 475, 547三个峰；通过产物的准分子离子峰及碎片离子分析PQQ分别与一分子乳酸发生酯化反应得产物PQQLa1，403，M+1峰，330，M‑72 乳酸峰；与二分子乳酸发生酯化反应得产物PQQLa2，475，M+1峰，402，M‑72 乳酸峰；与三分子乳酸发生酯化反应得产物PQQLa3，547，M+1峰；三种产物的积分面积比值PQQLa1/PQQLa2/PQQLa3为9.6/1.6/1；（5）3种产物峰面积AUS随反应时间的变化曲线将PQQ与乳酸分别配制以摩尔比为1︰5混合反应，避光，充分搅拌，置于37℃水浴孵育，于4、8、16、24、32、48h各时间点抽取反应液，甲醇稀释直接进样进行UPLC‑MS分析；采集【M+1】+分别为403，475，547的积分面积AUS，用AUS对时间作图，反应24h后基本处于稳定；（6）PQQ对D‑半乳糖D‑gal诱导大鼠衰老模型生物样本中乳酸含量的影响测定采用荧光增强试剂4‑(N‑氯甲酰甲基‑N‑甲氨基)‑7‑硝基‑2,1,3‑苯并恶二唑NBD‑COCl反应生成响应值较大的荧光物质，来检测生物样本中含量极低的La，最低检测浓度达10nM；色谱条件：美国WATERS 600高效液相色谱仪，2175荧光检测器，色谱柱Amethyst C18‑H 4.6×250mm、5µm，流动相15%乙腈‑H2O 含0.05%TFA，流速1mL/min，荧光检测激发波长483nm，发射波长530nm；血浆或细胞外液处理：10µL血浆/细胞外液+10µL去离子水+180µL甲醇，充分混匀，15000rpm/4℃离心5min，10µL上清液冷冻干燥，干燥物溶解在10µL去离子水中直接用于衍生反应；脑组织处理：脑组织称重取0.1g，加入0.9mL预冷的生理盐水，电动匀浆，15000rpm/4℃离心15min，取10µL上清液+10µL去离子水+180µL甲醇，充分混匀，15000rpm/4℃离心5min，10µL上清液冷冻干燥，干燥物溶解在10µL去离子水中直接用于衍生反应；衍生反应：10µL样本+10µL 50mM N‑甲基吗啉+5 µL 20mM NBD‑COCl，60℃反应15min，加150µL 2%TFA终止反应，取10µL直接进行HPLC分析；线性关系与检测限测定：精密称取乳酸对照品，加去离子水配成0.1，0.5，1，5，10，20，30，40，50mmol/L的对照溶液，按上述衍生反应方法反应后进行HPLC分析；所得积分面积对浓度进行线性回归，得方程式y =1602534x + 18831，R2 = 0.9999；在0.1～50mmol/L范围内线性良好，最小检出浓度为10nM，X为浓度mmol/L，Y为峰面积；重复性和精确度的测定：在确定的色谱条件下于同一天内连续进样6次测定，根据峰面积计算所得相对标准偏差为3.8%，n=6，保留时间的相对标准偏差为0.84%，n=6；生物样本中乳酸含量的测定：各组样本按上述方法处理后按上述反应条件衍生反应后进行HPLC分析，外标法计算得到乳酸的含量，结果为：D‑gal诱导衰老模型鼠血浆、脑组织和细胞外液中乳酸含量显著升高，PQQ给药组乳酸含量显著下降。