[发明专利]一种HPLC结合UPLC-MS检测PQQ对乳酸作用的方法

说明书

一种HPLC结合UPLC‑MS检测PQQ对乳酸作用的方法，属于生物分析技术领域。本发明采用UPLC方法研究了PQQ与乳酸的反应，优化了分离条件，使PQQ与多个反应产物达到分离。并采用UPLC‑MS对其反应产物进行了定性分析。本发明首次研究PQQ与乳酸的反应行为，在反应液中发现了3种产物，其准分子离子【M+H】⁺分别为403，475及547。PQQ分别与一分子乳酸、二分子乳酸、三分子乳酸发生酯化反应得产物PQQLa1、PQQLa2及PQQLa3。通过不同反应时间各生成物的峰面积发现主要以PQQLa1存在，酯化后的产物透过血脑屏障进入细胞外液，由此降低了细胞外液乳酸的含量。对研究PQQ在神经保护作用机制，尤其与衰老有关的疾病研究方面具有极为重要的研究价值。

技术领域

一种HPLC结合UPLC-MS检测PQQ对乳酸作用的方法，属于生物分析技术领域。

背景技术

中枢神经系统中的能量供应主要依赖外周血中的葡萄糖。血脑屏障中的主要成份星形胶质细胞摄取葡萄糖，经糖酵解产生乳酸释放至细胞外液，细胞外液反映神经细胞的生存环境。乳酸作为糖酵解的代谢产物，一直被认为对神经细胞有损害作用。因此，乳酸在神经系统中的作用一直为科学家所重视。已有报道急性脑外伤病人脑脊液乳酸含量升高；正常人脑脊液乳酸含量很低，报道发现恶性胶质瘤中乳酸含量明显升高；血清乳酸已作为脑损伤的生物标志物。美国科学院院刊PANS也报道了乳酸浓度的上升与衰老有关，这可能是线粒体DNA机能障碍引发小鼠大脑的代谢变化，由此改变控制乳酸形成的特定基因的表达，这种变化导致了大脑乳酸浓度增加。因此，检测乳酸浓度对探测中枢神经系统中与衰老有关的疾病具有重要意义，加速脑内乳酸代谢、降低乳酸的含量维持乳酸低浓度是治疗中枢神经系统疾病的一个重要手段。

吡咯并喹呤醌(PQQ)是一种氧化还原酶辅基，其结构式为：

其能够减少神经细胞死亡，在脑中能够促进神经因子的产生对神经细胞具有神经保护作用。PQQ在神经系统方面的重要功能可能与其特殊的化学结构有关，具有多羰基和多羧基的官能团，能够与多种活性基团发生反应。比如能够与多种氨基酸发生反应因而对氨基酸神经递质具有调节作用。而是否对与衰老基因有关的重要因素乳酸具有调节作用，至今无相关报道。

本发明采用UPLC方法研究了PQQ与乳酸的反应，优化了分离条件，使PQQ与多个反应产物达到分离。并采用UPLC-MS对其反应产物进行了定性分析。以往的研究显示PQQ结构中的两个羰基与氨基酸参与缩合反应生成恶唑类化合物，本文首次研究PQQ与乳酸的反应行为，在反应液中发现了3种产物，其准分子离子【M+H】⁺分别为403，475和547。通过产物的准分子离子峰及碎片离子初步分析PQQ分别与一分子乳酸、二分子乳酸、三分子乳酸发生酯化反应得产物PQQLa1、PQQLa2及PQQLa3。通过不同反应时间各生成物的峰面积发现主要以一分子酯化产物PQQLa1存在，酯化后的产物透过血脑屏障进入细胞外液，由此降低了细胞外液乳酸的含量。对研究PQQ在神经保护作用机制，尤其与衰老有关的疾病研究方面具有极为重要的研究价值。

乳酸含量的测定有比色法、EDTA滴定法、HPLC分析法、酶法、GC分析法，比色法及EDTA方法简单、快速，但灵敏度及精密度差；酶法对实验条件要求苛刻而且费用高；气相色谱法中乳酸易发生分解，影响其测定准确性。脑组织中乳酸含量极低，乳酸的紫外吸收极低，文献报道的HPLC法大多采用210nm检测，干扰因素较多，报道的最低检测浓度5µM，对于脑组织生物样本检测灵敏度太低。本发明采用荧光增强试剂NBD-COCl（4-(N-氯甲酰甲基-N-甲氨基)-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑），与乳酸反应生成响应值较大的荧光物质，测定了PQQ对D-gal（D-半乳糖）诱导大鼠衰老模型生物样本中乳酸含量的影响，最低检测浓度达10nM。测定结果显示PQQ能降低因D-gal引起的衰老模型大鼠血浆、脑组织及细胞外液乳酸含量的升高，对PQQ抗衰老的机理研究具有重要意义。

发明内容