[发明专利]一种HPLC结合UPLC-MS检测PQQ对乳酸作用的方法

权利要求书

1.一种HPLC结合UPLC-MS检测PQQ对乳酸作用的方法，其特征在于步骤为：

（1）UPLC分析条件

ACQUiTY UPLC@ BEH C18 column 2.1×100mm,1.7μm，流动相A：H₂O+0.2%TFA，B：甲醇；5/95 B/A洗脱5min，20 min梯度洗脱至75/25 B/A；检测波长322nm；

（2）波长的确定

称取一定量的PQQ及乳酸，分别用0.1M盐酸溶液溶解，配制成1mM 的PQQ溶液及1mM 的乳酸溶液，按v/v为1︰5混合，避光，于37℃水浴孵育24h，冰浴终止反应；紫外扫描图显示322nm紫外吸收较高；选择322nm 作为检测波长；

（3）流动相组分对分离的影响

在流动相中分别添加三氟乙酸TFA质量百分比为：0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.3 %TFA试验，当TFA含量为0.2%时，流动相A：H₂O+0.2%TFA，B：甲醇；5/95 B/A洗脱5min，20 min梯度洗脱至75/25 B/A；各组份峰型对称性较好，PQQ与3种生成物都能达到基线分离；

（4）UPLC-MS 对PQQ与乳酸的反应产物的定性分析

采用ACQUiTY UPLC@ BEH C18 column 2.1×100mm,1.7μm，质谱检测器SQ Detector 2及PDA检测器，优化质谱参数：

脱溶剂气温度：400℃；

脱溶剂气流量：600 L/h；

离子源温度：110℃；

锥孔气流量：50L/h；

毛细管电压：3000 V；

锥孔电压：30V；

质谱采用电喷雾正离子模式ESI+，质量扫描范围为m/z 50～800；

流动相A：H₂O+0.2%TFA，B：甲醇；5/95 B/A洗脱5min，20min梯度洗脱至75/25 B/A；进样10μL，反应液的ESI-MS谱图中，主要离子为m/z 403, 475, 547三个峰；通过产物的准分子离子峰及碎片离子分析PQQ分别与一分子乳酸发生酯化反应得产物PQQLa1，403，M+1峰，330，M-72 乳酸峰；与二分子乳酸发生酯化反应得产物PQQLa2，475，M+1峰，402，M-72 乳酸峰；与三分子乳酸发生酯化反应得产物PQQLa3，547，M+1峰；

三种产物的积分面积比值PQQLa1/PQQLa2/PQQLa3为9.6/1.6/1；

（5）3种产物峰面积AUS随反应时间的变化曲线

将PQQ与乳酸分别配制以摩尔比为1︰5混合反应，避光，充分搅拌，置于37℃水浴孵育，于4、8、16、24、32、48h各时间点抽取反应液，甲醇稀释直接进样进行UPLC-MS分析；采集【M+1】⁺分别为403，475，547的积分面积AUS，用AUS对时间作图，反应24h后基本处于稳定；

（6）PQQ对D-半乳糖D-gal诱导大鼠衰老模型生物样本中乳酸含量的影响测定

采用荧光增强试剂4-(N-氯甲酰甲基-N-甲氨基)-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑NBD-COCl反应生成响应值较大的荧光物质，来检测生物样本中含量极低的La，最低检测浓度达10nM；

色谱条件：美国WATERS 600高效液相色谱仪，2175荧光检测器，色谱柱Amethyst C18-H4.6×250mm、5µm，流动相15%乙腈-H₂O 含0.05%TFA，流速1mL/min，荧光检测激发波长483nm，发射波长530nm；

血浆或细胞外液处理：10µL血浆/细胞外液+10µL去离子水+180µL甲醇，充分混匀，15000rpm/4℃离心5min，10µL上清液冷冻干燥，干燥物溶解在10µL去离子水中直接用于衍生反应；

脑组织处理：脑组织称重取0.1g，加入0.9mL预冷的生理盐水，电动匀浆，15000rpm/4℃离心15min，取10µL上清液+10µL去离子水+180µL甲醇，充分混匀，15000rpm/4℃离心5min，10µL上清液冷冻干燥，干燥物溶解在10µL去离子水中直接用于衍生反应；

衍生反应：10µL样本+10µL 50mM N-甲基吗啉+5 µL 20mM NBD-COCl，60℃反应15min，加150µL 2%TFA终止反应，取10µL直接进行HPLC分析；

线性关系与检测限测定：精密称取乳酸对照品，加去离子水配成0.1，0.5，1，5，10，20，30，40，50mmol/L的对照溶液，按上述衍生反应方法反应后进行HPLC分析；所得积分面积对浓度进行线性回归，得方程式y =1602534x + 18831，R² = 0.9999；在0.1～50mmol/L范围内线性良好，最小检出浓度为10nM，X为浓度mmol/L，Y为峰面积；

重复性和精确度的测定：在确定的色谱条件下于同一天内连续进样6次测定，根据峰面积计算所得相对标准偏差为3.8%，n=6，保留时间的相对标准偏差为0.84%，n=6；

生物样本中乳酸含量的测定：各组样本按上述方法处理后按上述反应条件衍生反应后进行HPLC分析，外标法计算得到乳酸的含量，结果为：D-gal诱导衰老模型鼠血浆、脑组织和细胞外液中乳酸含量显著升高，PQQ给药组乳酸含量显著下降。