[发明专利]一种人正常阴道上皮3D分化培养物模型的构建方法与用途

摘要

本发明属于生物医药领域，公开了一种人正常阴道上皮3D分化培养物模型的构建方法与用途。提供2D生长培养基，获得分离培养自女性阴道癌旁正常组织的正常阴道上皮细胞，未导入任何外源基因，具有正常分化的生理功能。其构建人正常分化阴道上皮3D模型的方法为：2D培养基重悬单细胞，接种到气‑液培养装置中，生长培养基更换为分化培养基培养14‑21天。人阴道上皮3D气‑液培养物分化完全后，接种HSV‑2病毒液，获得HSV‑2病毒感染3D模型。这两种3D模型可用于人正常生殖道上皮的生理学研究和药物毒性安全性评价，HSV‑2病毒感染性疾病、性传播病原体感染性疾病的发病机理研究，以及抗病毒药物的研发。

主权项

一种人正常阴道上皮3D分化培养物模型的构建方法，包括如下步骤：A、人正常阴道上皮细胞原代分离培养：（1）在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集阴道癌患者手术切除的癌旁正常组织样品；(2) 消化液的配制：含胶原酶和分散酶均为0.2 mg/mL的原代上皮细胞生长培养基；其中，原代上皮细胞生长2D培养基的成分包括：DMEM与Ham’s F‑12 NUTRIENT MIX按体积比3:1混合的培养基，同时添加4‑6％胎牛血清、1‑3nM三碘甲状腺氨酸、0.4‑0.65％胰岛素铁硒传递蛋白、4‑6μg/ml铁传递蛋白、9‑11ng/mL表皮生长因子、0.3‑0.5μg/mL氢化可的松、35‑45μg/mL庆大霉素、45‑55nM calpeptin、35‑45ng/ml重组人IL‑1RA，及3μg/ml重组人R‑Spondin‑1；（3）用95～100%的乙醇洗分离的组织样品1次，再用0.01M，pH 7.4的PBS洗2次，然后将组织放入含冰上预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织中残留的脂肪；（4）将正常阴道组织样品放入10倍于组织样品体积的含步骤（2）所配制消化液的无菌培养皿中，37℃消化1～3小时；（5）将消化后的组织低速离心1000 rpm 5分钟，去除上清；（6）将细胞沉淀重悬于2‑5 mL的0.25%胰酶‑EDTA中，置于冰上1小时或室温消化10分钟；（7）然后加入10 mL含10% FBS的DMEM培养基，低速1000 rmp离心5分钟，尽量将上清去除干净；（8）加入2 mL37℃温水浴的5 mg/mL分散酶和200μL 的1 mg/mL DNase I，用无菌的P1000一次性塑料枪头反复吹打样品1分钟；（9）加入10 mL含10% FBS的DMEM，用40～70 μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速1000 rmp离心 5分钟，去除上清；（10）重悬细胞沉淀于2D培养基中，接种于T25或T75的培养瓶培养，培养条件是37℃、5% CO2；B、人正常阴道上皮细胞的传代培养：（1）当在T25或T75的培养瓶中培养的人正常阴道上皮细胞增殖至70～90%丰度时，用1×0.01M，pH 7.4 PBS洗涤细胞三次，再用0.05% 胰酶‑EDTA消化单层细胞2～5分钟；（2）加入10 mL DMEM中和消化反应1～2分种；（3）1000 rmp离心5分钟，弃上清；（4）以1:2，1:3，1:4或1:5比例重悬细胞沉淀于2D培养基，接种于培养瓶培养，培养条件是37℃、5% CO2得到人正常阴道上皮细胞；（5）必要时可将1×106上皮细胞重悬于1‑2 mL的含90%胎牛血清和10% DMSO的细胞冻存液中，储存于液氮中备用；C、人正常阴道上皮的气‑液3D培养：（1）将0.4µm的Millipore公司的12 mm Millicell PCF insert， 放入六孔板中，每孔最多放三个inserts；（2）用400µl 2D培养基重悬5x105个的人阴道上皮细胞，然后接种到每个insert中；（3）每个孔板内部即insert外围加入2ml的2D培养基；（4）将放有insert的六孔板放入湿热培养箱中，37℃，5%CO2培养时长为48小时；（5）将insert内部及外部中的培养基更换为3D分化培养基；3D分化培养基的配制：DMEM与F12按体积比1:1混合的培养基，同时添加0.5‑1.2 μM胰岛素（Sigma‑Aldrich I6634）、0.05‑0.2μM铁传递蛋白（Sigma‑Aldrich T0665），0.05‑0.15μM氢化可的松（Sigma‑Aldrich H0396），0.005‑0.015μM三碘甲状腺氨酸（Sigma‑Aldrich T6397），1‑4μM肾上腺素（Sigma‑Aldrich E4642），0.1‑1ng/mL表皮生长因子，2 x 10–8 ‑8 x 10–8 M视黄酸（Sigma‑Aldrich R2625），0.1‑1 μM磷酸乙醇胺（Sigma‑Aldrich P0503），0.1‑1 μM氨基乙醇（Sigma‑Aldrich E0135），1‑5μM硫酸锌（Sigma‑Aldrich Z0251），100 U/mL青霉素G硫酸（Sigma‑Aldrich P3032），100μg/mL链霉素硫酸盐（Sigma‑Aldrich S9137），0.5‑1.5 mM氯化钙（Sigma‑Aldrich C3881）；（6）将放有insert的培养皿放入湿热培养箱中，培养15‑17小时，使insert内部的细胞与细胞之间形成紧密连接；（7）移除insert内部及外部所有的培养基，外部的培养皿中加入3D分化培养基，开始分化培养；（8）在湿热培养箱中培养阴道上皮细胞14‑21天，培养条件为37℃，5%CO2,每2‑3天更换insert外围的培养基。