[发明专利]一种人正常阴道上皮3D分化培养物模型的构建方法与用途

权利要求书

1.一种人正常阴道上皮3D分化培养物模型的构建方法，包括如下步骤：

A、人正常阴道上皮细胞原代分离培养：

（1）在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集阴道癌患者手术切除的癌旁正常组织样品；

(2) 消化液的配制：含胶原酶和分散酶均为0.2 mg/mL的原代上皮细胞生长培养基；其中，原代上皮细胞生长2D培养基的成分包括：DMEM与Ham’s F-12 NUTRIENT MIX按体积比3:1混合的培养基，同时添加4-6％胎牛血清、1-3nM三碘甲状腺氨酸、0.4-0.65％胰岛素铁硒传递蛋白、4-6μg/ml铁传递蛋白、9-11ng/mL表皮生长因子、0.3-0.5μg/mL氢化可的松、35-45μg/mL庆大霉素、45-55nM calpeptin、35-45ng/ml重组人IL-1RA，及3μg/ml重组人R-Spondin-1；

（3）用95～100%的乙醇洗分离的组织样品1次，再用0.01M，pH 7.4的PBS洗2次，然后将组织放入含冰上预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织中残留的脂肪；

（4）将正常阴道组织样品放入10倍于组织样品体积的含步骤（2）所配制消化液的无菌培养皿中，37℃消化1～3小时；

（5）将消化后的组织低速离心1000 rpm 5分钟，去除上清；

（6）将细胞沉淀重悬于2-5 mL的0.25%胰酶-EDTA中，置于冰上1小时或室温消化10分钟；

（7）然后加入10 mL含10% FBS的DMEM培养基，低速1000 rmp离心5分钟，尽量将上清去除干净；

（8）加入2 mL37℃温水浴的5 mg/mL分散酶和200μL 的1 mg/mL DNase I，用无菌的P1000一次性塑料枪头反复吹打样品1分钟；

（9）加入10 mL含10% FBS的DMEM，用40～70 μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速1000 rmp离心 5分钟，去除上清；

（10）重悬细胞沉淀于2D培养基中，接种于T25或T75的培养瓶培养，培养条件是37℃、5%CO₂；

B、人正常阴道上皮细胞的传代培养：

（1）当在T25或T75的培养瓶中培养的人正常阴道上皮细胞增殖至70～90%丰度时，用1×0.01M，pH 7.4 PBS洗涤细胞三次，再用0.05% 胰酶-EDTA消化单层细胞2～5分钟；

（2）加入10 mL DMEM中和消化反应1～2分种；

（3）1000 rmp离心5分钟，弃上清；

（4）以1:2，1:3，1:4或1:5比例重悬细胞沉淀于2D培养基，接种于培养瓶培养，培养条件是37℃、5% CO₂得到人正常阴道上皮细胞；

（5）必要时可将1×10⁶上皮细胞重悬于1-2 mL的含90%胎牛血清和10% DMSO的细胞冻存液中，储存于液氮中备用；

C、人正常阴道上皮的气-液3D培养：

（1）将0.4µm的Millipore公司的12 mm Millicell PCF insert， 放入六孔板中，每孔最多放三个inserts；

（2）用400µl 2D培养基重悬5x10⁵个的人阴道上皮细胞，然后接种到每个insert中；

（3）每个孔板内部即insert外围加入2ml的2D培养基；

（4）将放有insert的六孔板放入湿热培养箱中，37℃，5%CO₂培养时长为48小时；

（5）将insert内部及外部中的培养基更换为3D分化培养基；

3D分化培养基的配制：DMEM与F12按体积比1:1混合的培养基，同时添加0.5-1.2 μM胰岛素、0.05-0.2μM铁传递蛋白，0.05-0.15μM氢化可的松，0.005-0.015μM三碘甲状腺氨酸，1-4μM肾上腺素，0.1-1ng/mL表皮生长因子，2 x 10^–8 -8 x 10^–8 M视黄酸，0.1-1 μM磷酸乙醇胺，0.1-1 μM氨基乙醇，1-5μM硫酸锌，100 U/mL青霉素G硫酸，100μg/mL链霉素硫酸盐，0.5-1.5 mM氯化钙；

（6）将放有insert的培养皿放入湿热培养箱中，培养15-17小时，使insert内部的细胞与细胞之间形成紧密连接；

（7）移除insert内部及外部所有的培养基，外部的培养皿中加入3D分化培养基，开始分化培养；

（8）在湿热培养箱中培养阴道上皮细胞14-21天，培养条件为37℃，5%CO_2,每2-3天更换insert外围的培养基。