[发明专利]一种人正常阴道上皮3D分化培养物模型的构建方法与用途

说明书

本发明属于生物医药领域，公开了一种人正常阴道上皮3D分化培养物模型的构建方法与用途。提供2D生长培养基，获得分离培养自女性阴道癌旁正常组织的正常阴道上皮细胞，未导入任何外源基因，具有正常分化的生理功能。其构建人正常分化阴道上皮3D模型的方法为：2D培养基重悬单细胞，接种到气‑液培养装置中，生长培养基更换为分化培养基培养14‑21天。人阴道上皮3D气‑液培养物分化完全后，接种HSV‑2病毒液，获得HSV‑2病毒感染3D模型。这两种3D模型可用于人正常生殖道上皮的生理学研究和药物毒性安全性评价，HSV‑2病毒感染性疾病、性传播病原体感染性疾病的发病机理研究，以及抗病毒药物的研发。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种人正常阴道上皮3D分化培养物模型的构建方法及其用途。

背景技术

人体重要器官都是由器官特异性分化的上皮细胞为其组成成分。这些特异性分化的上皮细胞与不同器官的特异性功能直接相关。生殖道粘膜上最接近于生殖道管腔的是上皮组织层，上皮层暴露于生殖道管腔内的各种病原体中，将生殖道中的病原体与生殖系统分隔开来。因此，生殖道上皮层是机体抵抗外界病原体的第一道天然的物理屏障。而这些重要器官一旦发生病变或退化就会威胁人类的健康，因为这些重要器官是很难被替换的，不同器官的特异性细胞也不能相互取代其它器官的细胞。这些特异性分化的细胞都是很难再生的，更不要说在体外进行培养增殖了。

目前对于分离自人和哺乳动物的原代上皮细胞的体外培养仍然是很困难的。应用无血清培养基，有的只能进行短期的原代培养(存活数天，如肺和胰腺等上皮细胞)，有的只能进行有限的传代培养(1-3代，如气管/角膜等上皮细胞)，有的甚至根本不能体外培养(如肝、结肠、前列腺等上皮细胞)，只有来自于人体皮肤的角化上皮细胞可以传代培养10代左右。而且从每个动物或活体组织样品中获得的上皮细胞产量仍然很低，包括细胞的数量、直接分离或短期培养的细胞纯度都是很低的，这些原代和传代上皮细胞的增殖速度也极为有限。为了在体外进行上皮细胞的培养，目前国外尝试通过遗传操作，如转入病毒(SV40 T或HPV16E6E7)或细胞癌基因，可以延长体外细胞存活的代数。然而遗传操作的最大缺点是会改变这些细胞的遗传背景和表型，以致让这些正常上皮细胞丢失其正常生理功能，因此这些细胞也不具备正常分化功能。

上皮组织层具有一定的极性，主要分为三层细胞：基底层、中层、表层，从而形成了两个不同的表面：顶端面和基底外侧面。顶端面主要面对外环境，而基底面则是接触底层细胞以及全身脉管系统，其形态学及分化程度在研究病原体感染激活的免疫反应中至关重要。性传播病原体如HSV-2病毒在生殖道粘膜上皮的复制以及向神经系统的传播，很大程度上依赖于极性分化的上皮细胞。由于生殖道分层极化上皮组织与其它上皮组织明显不同，对性传播病原体易感性以及药物的毒性反应有显著差异。因此，利用常规二维的细胞培养模型来研究性传播病原体感染机理始终存在着明显的局限性。另一方面，近几十年间的研究大多使用动物模型来研究病毒HSV-2疫苗，由于动物和人类之间的种属差异性，通过动物模型研发的HSV-2疫苗在人身上的效果不明显，因此这些处于动物研究水平的HSV-2疫苗很少能够运用到临床上。同时，利用动物模型并不能更进一步地研究微观的HSV-2感染致病机理。因此，建立一个接近人类生殖道上皮生理状态的研究模型意义重大。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种人正常阴道上皮3D分化培养物模型的构建方法，包括如下步骤：

A、人正常阴道上皮细胞原代分离培养：

(1)在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集阴道癌患者手术切除的癌旁正常组织样品。