[发明专利]一种抗根肿病的甘蓝‑大白菜远缘杂种的创制方法

摘要

本发明公开了一种抗根肿病的甘蓝‑大白菜远缘杂种的创制方法。该方法是以抗根肿病大白菜为母本，甘蓝为父本，进行人工杂交育种，采用重复授粉以及离体培养手段进行幼胚拯救，对获得的再生植株进行秋水仙素人工加倍，然后结合形态学、细胞DNA相对含量以及根肿病抗性鉴定，获得抗根肿病种间杂交新种质。本发明方法对促进甘蓝品种改良具有重要的理论研究和实际应用价值。

主权项

一种抗根肿病的甘蓝‑大白菜远缘杂种的创制方法,其特征在于包含以下步骤：(1)授粉方法：以抗根肿病大白菜为母本，甘蓝为父本，配置杂交组合,采用人工剥蕾去雄重复授粉的方法，取父本新鲜花粉，涂抹在母本去雄的花蕾柱头上；(2)胚珠培养：取授粉后10d的子房消毒灭菌，剥取子房中的胚珠接种到胚挽救培养基上,在环境25±0.5℃，光照强度50‑100μmol·m–2·s–1，光照时长12‑14h·d–1条件下培养25～30d，所述的胚挽救培养基为：MS+0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6‑BA+0.6g/L水解酪蛋白+7g/L琼脂+25g/L蔗糖，pH为5.90～5.95；(3)分化培养：待幼胚长至子叶形胚时，接入分化培养基诱导不定芽分化，所述的分化培养基为：MS+0.1mg/L NAA+1mg/L 6‑BA+6g/L琼脂+28g/L蔗糖，pH为5.90～5.95；(4)继代培养：20～30d后转入继代培养，继代培养基为：MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/L6‑BA+7g/L琼脂+25g/L蔗糖，pH为5.90～5.95；(5)生根培养：继代2周后接入生根培养基诱导生根，所述的生根培养基为：1/2MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L IBA+20g/L糖+7g/L琼脂，pH为5.90～5.95；(6)人工加倍：将修剪好的植株根部浸泡在配制的秋水仙素溶液中进行加倍，所述的处理条件为含2％二甲基亚砜浓度为0.4％的秋水仙素溶液中处理18‑20h，处理完毕后，将根部的秋水仙素残液冲洗干净，最后定植于含有草炭土、珍珠岩和蛭石的穴盘中；(7)形态学鉴定：对幼苗营养生长阶段、生殖生长阶段的主要形态特征进行观察；(8)细胞DNA相对含量测定：用流式细胞仪对后代加倍植株进行细胞DNA相对含量测定；(9)根肿病抗性鉴定：通过菌土法接种鉴定和抗根肿病基因CRb的分子标记验证相结合鉴定根肿病抗性，将基质灭菌后，每克灭菌土中接种0.001g病根，然后直接将鉴定材料播于菌土中，于25‑28℃下培养，2个月后拔出幼苗，洗净根部杂质，观察发病情况；同时，利用与大白菜抗根肿病CRb基因紧密连锁的SSR引物TCR13对后代植株进行分子标记鉴定，当后代材料的扩增谱带中出现抗根肿病大白菜所具有的特异条带时，即可判定其为携带CRb基因的真杂种。