[发明专利]一种抗根肿病的甘蓝‑大白菜远缘杂种的创制方法

权利要求书

1.一种抗根肿病的甘蓝-大白菜远缘杂种的创制方法,其特征在于包含以下步骤：

(1)授粉方法：以抗根肿病大白菜为母本，甘蓝为父本，配置杂交组合,采用人工剥蕾去雄重复授粉的方法，取父本新鲜花粉，涂抹在母本去雄的花蕾柱头上；

(2)胚珠培养：取授粉后10d的子房消毒灭菌，剥取子房中的胚珠接种到胚挽救培养基上,在环境25±0.5℃，光照强度50-100μmol·m^–2·s^–1，光照时长12-14h·d^–1条件下培养25～30d，所述的胚挽救培养基为：MS+0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白+7g/L琼脂+25g/L蔗糖，pH为5.90～5.95；

(3)分化培养：待幼胚长至子叶形胚时，接入分化培养基诱导不定芽分化，所述的分化培养基为：MS+0.1mg/L NAA+1mg/L 6-BA+6g/L琼脂+28g/L蔗糖，pH为5.90～5.95；

(4)继代培养：20～30d后转入继代培养，继代培养基为：MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/L6-BA+7g/L琼脂+25g/L蔗糖，pH为5.90～5.95；

(5)生根培养：继代2周后接入生根培养基诱导生根，所述的生根培养基为：1/2MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L IBA+20g/L糖+7g/L琼脂，pH为5.90～5.95；

(6)人工加倍：将修剪好的植株根部浸泡在配制的秋水仙素溶液中进行加倍，所述的处理条件为含2％二甲基亚砜浓度为0.4％的秋水仙素溶液中处理18-20h，处理完毕后，将根部的秋水仙素残液冲洗干净，最后定植于含有草炭土、珍珠岩和蛭石的穴盘中；

(7)形态学鉴定：对幼苗营养生长阶段、生殖生长阶段的主要形态特征进行观察；

(8)细胞DNA相对含量测定：用流式细胞仪对后代加倍植株进行细胞DNA相对含量测定；

(9)根肿病抗性鉴定：通过菌土法接种鉴定和抗根肿病基因CRb的分子标记验证相结合鉴定根肿病抗性，将基质灭菌后，每克灭菌土中接种0.001g病根，然后直接将鉴定材料播于菌土中，于25-28℃下培养，2个月后拔出幼苗，洗净根部杂质，观察发病情况；同时，利用与大白菜抗根肿病CRb基因紧密连锁的SSR引物TCR13对后代植株进行分子标记鉴定，当后代材料的扩增谱带中出现抗根肿病大白菜所具有的特异条带时，即可判定其为携带CRb基因的真杂种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述的杂交组合的配置为：抗根肿病大白菜为母本，甘蓝为父本。其中母本为引进的1份对根肿病表现免疫、携带CRb基因的大白菜材料。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中子房消毒灭菌方法为：用75％的乙醇消毒1min，然后用7％(体积分数)的次氯酸钠灭菌15min，再用用无菌水冲洗3次，每次5min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(6)中秋水仙素溶液进行加倍处理时一定要没过根部。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(6)中草炭土、珍珠岩和蛭石的体积比为8:1:1。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(9)中所述的与大白菜抗根肿病CRb基因紧密连锁的SSR引物TCR13上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(9)中当后代材料的扩增谱带中出现抗根肿病大白菜所具有的313bp特异条带时，即可判定其为携带CRb基因的真杂种。