[发明专利]一种抗根肿病的甘蓝‑大白菜远缘杂种的创制方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术育种领域，涉及一种抗根肿病的甘蓝-大白菜远缘杂种的创制方法。

背景技术

根肿病是由根肿菌属芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron.)侵染引起的、危害十字花科作物的一种传染性非常强的土壤病害，结球甘蓝(Brassica oleracea L.Var.Capitata,，2n＝2x＝CC＝18，简称甘蓝)是受其危害严重的寄主之一；目前生产上非常缺乏抗根肿病甘蓝品种。甘蓝对根肿病抗性属于数量性状遗传，由多基因控制，易受环境影响；而且主要是隐性基因，这就使得利用常规育种方法改良甘蓝根肿病抗性存在困难并且进展缓慢。国内外对大白菜抗根肿病的研究表明，大白菜对根肿病菌的侵染大多表现受显性单基因控制。其中位于A3连锁群的CRb基因对根肿菌生理小种2、4和8表现抗性，是一个优良的抗性基因。

发明内容

本发明的目的是针对目前甘蓝资源遗传基础狭窄，抗根肿病资源缺乏这一现状，提供一套利用胚胎拯救获得甘蓝-大白菜远缘杂种的方法，创造一批抗根肿病的甘蓝-大白菜远缘杂种；同时为扩大甘蓝基因库，引进近缘种中优异的目标性状(基因)，形成一套甘蓝品种改良的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种抗根肿病的甘蓝-大白菜远缘杂种的创制方法，包括以下步骤：

(1)授粉方法：以抗根肿病大白菜为母本，甘蓝为父本，配置杂交组合,采用人工剥蕾去雄重复授粉的方法，取父本新鲜花粉，涂抹在母本去雄的花蕾柱头上；

(2)胚珠培养：取授粉后10d的子房消毒灭菌，剥取子房中的胚珠接种到胚挽救培养基上,在环境25±0.5℃，光照强度50-100μmol·m^–2·s^–1，光照时长12-14h·d^–1条件下培养25～30d，所述的胚挽救培养基为：MS+0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白+7g/L琼脂+25g/L蔗糖，pH为5.90～5.95；

(3)分化培养：待幼胚长至子叶形胚时，接入分化培养基诱导不定芽分化，所述的分化培养基为：MS+0.1mg/L NAA+1mg/L 6-BA+6g/L琼脂+28g/L蔗糖，pH为5.90～5.95；

(4)继代培养：20～30d后转入继代培养，继代培养基为：MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/L6-BA+7g/L琼脂+25g/L蔗糖，pH为5.90～5.95；

(5)生根培养：继代2周后接入生根培养基诱导生根，所述的生根培养基为：1/2MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L IBA+20g/L糖+7g/L琼脂，pH为5.90～5.95；

(6)人工加倍：将修剪好的植株根部浸泡在配制的秋水仙素溶液中进行加倍，所述的处理条件为含2％二甲基亚砜浓度为0.4％的秋水仙素溶液中处理18-20h，处理完毕后，将根部的秋水仙素残液冲洗干净，最后定植于含有草炭土、珍珠岩和蛭石的穴盘中；

(7)形态学鉴定：对幼苗营养生长阶段、生殖生长阶段的主要形态特征进行观察；

(8)细胞DNA相对含量测定：用流式细胞仪对后代加倍植株进行细胞DNA相对含量测定；

(9)根肿病抗性鉴定：通过菌土法接种鉴定和抗根肿病基因CRb的分子标记验证相结合鉴定根肿病抗性，将基质灭菌后，每克灭菌土中接种0.001g病根，然后直接将鉴定材料播于菌土中，于25-28℃下培养，2个月后拔出幼苗，洗净根部杂质，观察发病情况；同时，利用与大白菜抗根肿病CRb基因紧密连锁的SSR引物TCR13对后代植株进行分子标记鉴定，当后代材料的扩增谱带中出现抗根肿病大白菜所具有的特异条带时，即可判定其为携带CRb基因的真杂种。

其中，步骤(1)中所述的杂交组合的配置为：抗根肿病大白菜为母本，甘蓝为父本。其中母本为引进的1份对根肿病表现免疫、携带CRb基因的大白菜材料。

步骤(2)中子房消毒灭菌方法为：用75％(体积分数)的乙醇消毒1min，然后用7％(体积分数)的次氯酸钠灭菌15min，再用用无菌水冲洗3次，每次5min。

步骤(6)中秋水仙素溶液进行加倍处理时一定要没过根部。

步骤(6)中草炭土、珍珠岩和蛭石的体积比为8:1:1。