[发明专利]一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法

摘要

本发明属于生物医药检测技术领域，涉及一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法，经过IVIG经酶切及层析获得双链Fc片段、IVIG去除糖类保护剂处理、唾液酸解离、荧光衍生、高效液相色谱检测、标准曲线的绘制和检测结果代入标准曲线计算步骤，得IVIG唾液酸总含量和Fc片段的唾液酸含量；Fab段唾液酸含量为=（IVIG中的唾液酸总含量×IVIG分子量‑Fc片段的唾液酸含量×Fc片段分子量）/Fab片段分子量，式中IVIG分子量为150,000 Da，Fc片段分子量为55,000 Da，Fab片段分子量为95,000 Da。本发明简单，精确、灵敏度高，重复性和准确性高。

主权项

1. 一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法，其特征在于：包括以下具体步骤：步骤一：待测样品预处理：（1）双链Fc片段的纯化：取IVIG，酶切、蛋白G层析和分子筛层析后得到双链Fc片段；酶切条件为在IVIG中加入EDTA‑Na₂，L‑半胱氨酸盐酸盐和木瓜蛋白酶，37℃，4h，EDTA‑Na₂、L‑半胱氨酸盐酸盐和木瓜蛋白酶用量比为1：5：20；分子筛层析为将蛋白G层析柱层析后收集的含Fc片段的组分，上样于分离范围包含5000Da‑300000Da的分子筛，将样品中的各组分按照分子量分离开来，收集分子量为50000Da的蛋白，即为完整的双链Fc片段；（2）IVIG去除糖类保护剂处理；取IVIG，分子筛层析去除糖类保护剂；再将去除糖类保护剂后的IVIG和纯化后的双链Fc片段分别进行步骤二至步骤五处理，得IVIG中的唾液酸总含量和Fc片段的唾液酸含量；步骤二： 唾液酸解离：用酸性溶剂将待测样品的唾液酸解离下来；步骤三：荧光衍生，将DMB衍生液加入步骤二中，50℃金属浴避光反应2.5h；步骤四：高效液相色谱检测和标准曲线的绘制：用高效液相色谱仪进行检测，再以标准曲线样品梯度浓度为横坐标，标准曲线样品经高效液相色谱检测的衍生峰面积为纵坐标，采用线性方程绘制标准曲线；步骤五：唾液酸含量的计算：将待测样品的经高效液相色谱检测的衍生峰面积代入标准曲线，计算样品中每毫升溶液唾液酸含量，将计算的结果除以样品溶液的蛋白浓度，即得到每mg样品中唾液酸含量；其中，Fab段唾液酸含量为=（IVIG中的唾液酸总含量×IVIG分子量‑Fc片段的唾液酸含量×Fc片段分子量）/Fab片段分子量；式中，IVIG分子量为150, 000 Da，Fc片段分子量为55, 000 Da，Fab片段分子量为95, 000 Da。