[发明专利]一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法

说明书

本发明属于生物医药检测技术领域，涉及一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法，经过IVIG经酶切及层析获得双链Fc片段、IVIG去除糖类保护剂处理、唾液酸解离、荧光衍生、高效液相色谱检测、标准曲线的绘制和检测结果代入标准曲线计算步骤，得IVIG唾液酸总含量和Fc片段的唾液酸含量；Fab段唾液酸含量为=（IVIG中的唾液酸总含量×IVIG分子量‑Fc片段的唾液酸含量×Fc片段分子量）/Fab片段分子量，式中IVIG分子量为150,000 Da，Fc片段分子量为55,000 Da，Fab片段分子量为95,000 Da。本发明简单，精确、灵敏度高，重复性和准确性高。

技术领域

本发明属于生物医药检测技术领域，具体涉及一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法。

背景技术

静注人免疫球蛋白pH4(intravenous immunoglobulins，IVIG)，是一种重要的人血浆蛋白制品，主要成分是免疫球蛋白IgG。

唾液酸(Sialic acid)是一类天然的碳水化合物，通常以低聚糖、糖脂或糖蛋白的形式存在，为9-碳单糖的衍生物。是一种能使唾液产生光滑感觉的负电荷离子。它不仅具有诱导入侵病菌的作用，目前认知是神经节苷脂的传递递质，并且是大脑的组成部分。唾液酸可以阻止病菌入侵，同时也是流感病毒的受体，是流感病毒结合在黏液细胞中的结合位点。唾液酸修饰的浓度对生物大分子发挥功能有着非常重要的影响，获得对唾液酸进行准确快速的定量分析方法对于药物的临床使用、质量检测等方面具有重要的应用价值。

IgG作为一种糖蛋白，其中唾液酸位于其Fab段和Fc段N-端糖链终端。Fab段即抗原结合片段(fragment antigen binding,Fab),相当于抗体分子的两个臂，由一条完整的轻链和重链的VH和CH1结构域组成；与异物蛋白结合。Fc段即可结晶片段(fragmentcrystallizable,Fc)，相当于IgG的CH2和CH3结构域。与吞噬细胞结合。IgG在酶的作用下可降解为Fab片段和Fc片段。

IVIG中IgG Fc片段唾液酸化程度会影响其与Fc受体系统的结合，对IVIG发挥抗炎疗效至关重要，IVIg中IgG Fc片段唾液酸含量的多少是其治疗各种炎症疾病的重要指标。而Fab段的唾液酸化程度会影响抗原抗体的结合，影响IVIG在治疗免疫缺陷疾病时的效果。目前对唾液酸含量的检测，多限于样品或生物制品总唾液酸含量的检测，尚无专门针对Fab片段和Fc片段分开进行检测，而这两者的唾液酸含量的差异在临床使用中有不同的意义。

根据目前药典相关规定及已发表的分光光度法，HPLC方法精确、灵敏度更高。但目前尚无文献报道HPLC-荧光法应用于IVIG制品中唾液酸含量的检测。因此，有必要建立一种用于测定IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的方法。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法，能够测定IVIG制品IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量，方法简单，精确、灵敏度高，重复性和准确性高。

解决以上技术问题的一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法，所述测定方法为经过双链Fc片段的纯化步骤、IVIG去除糖类保护剂处理步骤、唾液酸解离步骤、荧光衍生步骤、高效液相色谱检测和标准曲线的绘制步骤，即得唾液酸总含量和Fc片段的唾液酸含量；其中，Fab段唾液酸含量为＝(IVIG中的唾液酸总含量×IVIG分子量-Fc片段的唾液酸含量×Fc片段分子量)/Fab片段分子量，式中IVIG分子量为150,000Da，Fc片段分子量为55,000Da，Fab片段分子量为95,000Da。

糖类保护剂是指单糖如葡萄糖,双糖如蔗糖、海藻糖、乳糖，聚糖有葡聚糖等，都具有大量的自由羟基。

本发明中一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法，包括以下具体步骤：