[发明专利]一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法

权利要求书

1. 一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法，其特征在于：包括以下具体步骤：

步骤一：待测样品预处理：

（1）双链Fc片段的纯化：取IVIG，酶切、蛋白G层析和分子筛层析后得到双链Fc片段；酶切条件为在IVIG中加入EDTA-Na₂，L-半胱氨酸盐酸盐和木瓜蛋白酶，37℃，4h，EDTA-Na₂、L-半胱氨酸盐酸盐和木瓜蛋白酶用量比为1：5：20；分子筛层析为将蛋白G层析柱层析后收集的含Fc片段的组分，上样于分离范围包含5000Da-300000Da的分子筛，将样品中的各组分按照分子量分离开来，收集分子量为50000Da的蛋白，即为完整的双链Fc片段；

（2）IVIG去除糖类保护剂处理；取IVIG，分子筛层析去除糖类保护剂；再将去除糖类保护剂后的IVIG和纯化后的双链Fc片段分别进行步骤二至步骤五处理，得IVIG中的唾液酸总含量和Fc片段的唾液酸含量；

步骤二： 唾液酸解离：用酸性溶剂将待测样品的唾液酸解离下来；

步骤三：荧光衍生，将DMB衍生液加入步骤二中，50℃金属浴避光反应2.5h；

步骤四：高效液相色谱检测和标准曲线的绘制：用高效液相色谱仪进行检测，再以标准曲线样品梯度浓度为横坐标，标准曲线样品经高效液相色谱检测的衍生峰面积为纵坐标，采用线性方程绘制标准曲线；

步骤五：唾液酸含量的计算：

将待测样品的经高效液相色谱检测的衍生峰面积代入标准曲线，计算样品中每毫升溶液唾液酸含量，将计算的结果除以样品溶液的蛋白浓度，即得到每mg样品中唾液酸含量；

其中，Fab段唾液酸含量为=（IVIG中的唾液酸总含量×IVIG分子量-Fc片段的唾液酸含量×Fc片段分子量）/Fab片段分子量；式中，IVIG分子量为150, 000 Da，Fc片段分子量为55, 000 Da，Fab片段分子量为95, 000 Da。

2.根据权利要求1所述的一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法，其特征在于：所述步骤一中待测样品溶液蛋白浓度为0.5~4mg/ml 。

3.根据权利要求2所述的一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法，其特征在于：所述步骤一中待测样品溶液蛋白浓度0.5~2mg/ml。

4.根据权利要求3所述的一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法，其特征在于：所述步骤一中待测样品溶液蛋白浓度为0.5mg/ml。

5.根据权利要求1所述的一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法，其特征在于：所述唾液酸解离步骤为取300μL的 1mg/ml待测样品加入100μL 0.1M三氟乙酸，金属浴80℃，1h，产物经0.22μm滤膜过滤 。

6.根据权利要求1所述的一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪中色谱柱：Waters Symmetry C18 液相色谱柱4.6×250 5μm ，柱温30℃，荧光检测器激发波长373nm，发射波长448nm，流动相为甲醇、乙腈和超纯水，其中甲醇：乙腈：超纯水=7:8:85，流速为0.9mL/min。

7.根据权利要求1所述的一种IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的测定方法，其特征在于：所述标准曲线的绘制中1mg唾液酸标准品加10mL水配制成0.1mg/mL的唾液酸标准溶液，加水分别稀释至5、10、20、30、40ug/mL，取300μL各浓度标准品溶液，分别加入50μLDMB衍生液，50℃金属浴避光反应2.5h，20μL进样检测。