[发明专利]一种建立稳定转基因的牙鲆胚胎细胞株方法

摘要

本发明提供一种建立稳定转基因的牙鲆胚胎细胞株方法，是把牙鲆广泛表达的β‑actin启动子启动的增强型绿色荧光蛋白且能表达G418抗性蛋白的质粒转染牙鲆胚胎细胞。24h后,荧光显微镜下观察EGFP表达，并通过G418筛选得到稳定遗传表达的胚胎细胞。本发明方法可将在牙鲆中广泛表达的β‐actin启动的外源基因有效转入牙鲆胚胎细胞，并且可以在牙鲆胚胎细胞中稳定遗传表达，为鲆鲽鱼类基因研究提供了一种新的方法，解决了因鲆鲽鱼类细胞瞬时转染效率低而难以进行细胞水平基因功能分析研究的问题，为鲆鲽鱼类分子水平遗传育种工作提供了新的技术手段，提供了用于使海水鱼类细胞系稳定遗传转基因方法。

主权项

1.一种建立稳定转基因的牙鲆胚胎细胞株方法，其特征在于，所述的方法包含如下的步骤：1)转基因载体构建：应用无启动子的pEGFP‑1质粒体作为载体，在外源基因之前插入β‑actin基因启动子构建成转基因质粒；所述的β‑actin基因启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；2)制备脂质体和外源DNA质粒复合物：将阳离子脂质体溶液与目的转基因质粒溶液混合制成脂质体和外源DNA质粒复合物；3)转染牙鲆胚胎细胞：待牙鲆胚胎细胞汇合度达70％—80％时，把脂质体和外源DNA质粒复合物加入到细胞培养基中对牙鲆胚胎细胞进行转染；4)G418筛选牙鲆阳性胚胎细胞：转染24h后用600μg/mL的G418对荧光检测呈阳性的牙鲆胚胎细胞进行筛选，之后更换为含有300μg/mL G418的DMEM/F12对阳性细胞进行富集。