[发明专利]一种建立稳定转基因的牙鲆胚胎细胞株方法有效
| 申请号： | 201610819451.7 | 申请日： | 2016-09-12 |
| 公开（公告）号： | CN106399370B | 公开（公告）日： | 2019-10-11 |
| 发明（设计）人： | 汪波;张全启;王慧贞;杨帆;齐洁;王志刚;王旭波;于海洋;贺艳;刘金相 | 申请（专利权）人： | 中国海洋大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N5/10 |
| 代理公司： | 青岛海昊知识产权事务所有限公司 37201 | 代理人： | 曾庆国 |
| 地址： | 266003 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 牙鲆胚胎 稳定遗传 鲆鲽鱼类 细胞 牙鲆 稳定转基因 细胞株 增强型绿色荧光蛋白 基因功能分析 瞬时转染效率 荧光显微镜 分子水平 海水鱼类 基因研究 技术手段 胚胎细胞 外源基因 细胞水平 遗传育种 质粒转染 转基因 蛋白 转入 观察 研究 | ||
【权利要求书】：
1.一种建立稳定转基因的牙鲆胚胎细胞株方法，其特征在于，所述的方法包含如下的步骤：
1)转基因载体构建：
应用无启动子的pEGFP-1质粒体作为载体，在外源基因之前插入β-actin基因启动子构建成转基因质粒；所述的β-actin基因启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；
2)制备脂质体和外源DNA质粒复合物：
将阳离子脂质体溶液与目的转基因质粒溶液混合制成脂质体和外源DNA质粒复合物；
3)转染牙鲆胚胎细胞：
待牙鲆胚胎细胞汇合度达70％—80％时，把脂质体和外源DNA质粒复合物加入到细胞培养基中对牙鲆胚胎细胞进行转染；
4)G418筛选牙鲆阳性胚胎细胞：
转染24h后用600μg/mL的G418对荧光检测呈阳性的牙鲆胚胎细胞进行筛选，之后更换为含有300μg/mL G418的DMEM/F12对阳性细胞进行富集。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中细胞转染中阳离子脂质体溶液与目的质粒溶液的体积比为18～22:1。
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