[发明专利]一种建立稳定转基因的牙鲆胚胎细胞株方法

说明书

本发明提供一种建立稳定转基因的牙鲆胚胎细胞株方法，是把牙鲆广泛表达的β‑actin启动子启动的增强型绿色荧光蛋白且能表达G418抗性蛋白的质粒转染牙鲆胚胎细胞。24h后,荧光显微镜下观察EGFP表达，并通过G418筛选得到稳定遗传表达的胚胎细胞。本发明方法可将在牙鲆中广泛表达的β‐actin启动的外源基因有效转入牙鲆胚胎细胞，并且可以在牙鲆胚胎细胞中稳定遗传表达，为鲆鲽鱼类基因研究提供了一种新的方法，解决了因鲆鲽鱼类细胞瞬时转染效率低而难以进行细胞水平基因功能分析研究的问题，为鲆鲽鱼类分子水平遗传育种工作提供了新的技术手段，提供了用于使海水鱼类细胞系稳定遗传转基因方法。

技术领域

本发明属于海洋鱼类遗传学技术领域，具体涉及一种建立稳定转基因的牙鲆胚胎细胞株方法。

背景技术

细胞转染指真核细胞由于外源DNA或RNA掺入而获得新遗传标志的过程。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。迄今为止，多种外源基因转染细胞的方法已被开发。主要包括以病毒介导的外源基因转染细胞方法和非病毒介导的细胞转染方法。以上方法在植物和哺乳动物上已成功建立多种稳定遗传表达的细胞株。

然而，在牙鲆等海水鱼类中高效的细胞转染方法目前尚未见报道，在海水鱼细胞中建立稳定转基因的细胞株更是很少涉及，这已成为在细胞水平上分析和研究海水鱼类基因功能的主要瓶颈之一。因此，探究海水鱼类中高效的细胞转染方法，建立稳定遗传的海水鱼类细胞株，对于研究海水鱼类基因功能分析等至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种建立稳定转基因的牙鲆胚胎细胞株方法，即利用脂质体和外源DNA质粒形成复合物进行转染细胞，再利用G418对转染后的细胞进行筛选，从而获得可稳定遗传的转基因细胞株。

1)转基因载体构建：

应用无启动子的pEGFP-1质粒体作为载体，在外源基因之前插入β-actin基因启动子构建成转基因质粒；

2)制备脂质体和外源DNA质粒复合物：

将阳离子脂质体溶液与目的转基因质粒溶液混合制成脂质体和外源DNA质粒复合物；

3)转染牙鲆胚胎细胞：

待牙鲆胚胎细胞汇合度达70％—80％时，把脂质体和外源DNA质粒复合物加入到细胞培养基中对牙鲆胚胎细胞进行转染；

4)G418筛选牙鲆阳性胚胎细胞：

转染24h后用一定浓度的G418对荧光检测呈阳性的牙鲆胚胎细胞进行筛选，之后更换为含有G418的DMEM/F12对阳性细胞进行富集；

所述的步骤2)中细胞转染中阳离子脂质体溶液与目的质粒溶液的体积比为22:1。

所述的步骤4)中600μg/m L的G418为筛选牙鲆胚胎细胞的最佳浓度；使用含有300μg/mL G418的DMEM/F12对阳性细胞进行富集。

本发明方法可将在牙鲆中广泛表达的β‐actin启动的外源基因有效转入牙鲆胚胎细胞，并且可以在牙鲆胚胎细胞中稳定遗传表达，为鲆鲽鱼类基因研究提供了一种新的方法，解决了因鲆鲽鱼类细胞瞬时转染效率低而难以进行细胞水平基因功能分析研究的问题，为鲆鲽鱼类分子水平遗传育种工作提供了新的技术手段，提供了用于使海水鱼类细胞系稳定遗传转基因方法。

附图说明

图1：本发明构建的质粒图谱，

图2：G418浓度的筛选图，其中A‐J分别为用含有0、100、200、300、400、500、600、700、800、900μg/mL G418的DMEM/F12处理两周的结果；

图3：转染24h后荧光结果图；