[发明专利]一种重组人角质细胞生长因子生物学活性检测方法

摘要

本发明提供了一种重组人角质细胞生长因子(rhKGF‑1)检测方法，它包括以下步骤1)细胞培养；2)细胞接种，控制细胞密度；3)rhKGF‑1样品经处理后，进行浓度梯度稀释，并在各rhKGF‑1浓度稀释度中加入5‑乙炔基‑2'‑脱氧尿苷(EdU)，以制备含有一系列rhKGF‑1浓度稀释度的上样样品；4)对步骤2)所述的细胞板中的细胞进行洗涤，去除培养基；5)将步骤3)所述的上样样品上样于步骤4)中所述的细胞培养板中，培养孵育细胞；6)将步骤5)所述的细胞进行固化和透化处理后，EdU进行“Click‑iT”反应；7)将步骤6)中经过处理后的细胞放置于多功能酶标仪中读取荧光强度(RFU)，计算rhKGF‑1生物学活性。本发明所使用的方法具有检测背景低、灵敏度高、专属性强、准确度高、重复性好等优点，尤其适用于rhKGF‑1生物学活性的检测及质量标准的建立。

主权项

一种重组人角质细胞生长因子(Recombinant human keratinocyte growth factor‑1，rhKGF‑1)生物活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)细胞培养，在含有重组人表皮生长因子(Recombinat human Epidermal Growth Factor，rhEGF)的培养基中将恒河猴肺部支气管上皮细胞(4MBr‑5细胞)培养至对数生长期；2)取步骤1)对数生长期的4MBr‑5细胞，经处理过程，接种于细胞培养板中，继续培养，所述的细胞接种于细胞培养板中的密度为1.0×105/ml；3)rhKGF‑1样品经处理后，做若干个浓度梯度稀释的rhKGF‑1供试品溶液，并在各稀释浓度的rhKGF‑1供试品溶液中加入5‑乙炔基‑2'‑脱氧尿苷(5‑ethynyl‑2'‑deoxyuridine，EdU)，以制备为含有不同浓度rhKGF‑1的上样样品；所述的rhKGF‑1样品处理是采用培养基将rhKGF‑1样品稀释至上样起始浓度为50～100ng/ml，所述的培养基是含有胎牛血清的Ham’s F‑12测试培养基，所述的胎牛血清体积比为3～7％；所述的上样样品中所含EdU浓度为10～20μM；4)对步骤2)所述的细胞培养板进行洗涤，去除培养基；5)将步骤3)所述的上样样品上样于步骤4)中所述的细胞培养板中，并培养孵育细胞，所述的培养孵育细胞的时间是46～48h；6)将步骤5)所述的细胞进行固化和透化处理后，EdU进行“Click‑iT”反应；7)将步骤6)中经过处理后的细胞放置于多功能酶标仪中读取荧光强度，通过数据处理计算rhKGF‑1生物学活性。