[发明专利]一种重组人角质细胞生长因子生物学活性检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制品质量检测分析领域，具体涉及一种重组人角质细胞生长因子生物学活性检测方法。

背景技术

人角质细胞生长因子-1(human keratinocyte growth factor-1，hKGF-1)，即成纤维生长因子7(fibroblast growth factor-7，FGF-7)，hKGF-1由间质细胞产生，通过旁分泌特异性作用于上皮细胞，是一种可刺激胚胎发育，促进上皮细胞增殖和生长，参与免疫重建，以及肿瘤形成与发展等重要生物学功能的细胞生长因子。

美国Amgen公司开发的静脉注射液Palifermin(商品名kepivance，含重组hKGF-1(rhKGF-1))2004年12月获美国FDA批准上市，用于减少正在进行放化疗以准备骨髓移植的恶性血液病患者患口腔黏膜炎的几率，或缩短该疾病的发病时间。该rhKGF-1是由大肠杆菌表达的天然hKGF-1的N末端前23个氨基酸残基缺失的hKGF类似物，可增强hKGF-1的稳定性和生物学活性。rhKGF-1的生物学活性是rhKGF-1产品质量控制的重要评价参数，关系到rhKGF-1的治疗效果，因此，应建立切实可行的生物学活性分析方法，对rhKGF-1产品进行有效的质量控制。

目前，rhKGF-1生物学活性常规检测方法主要通过检测细胞代谢或DNA合成来检测细胞的增殖活性。其中，检测细胞代谢方法有MTT比色法和CCK8比色法、Hoechst荧光染色法。MTT法和CCK8法检测细胞增殖原理基本一致，都是检测的化学试剂被活细胞线粒体中脱氢酶还原后生成甲瓒产物(Formazan)，而死细胞无此功能。在一定细胞数范围内，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，因此利用这一特性可反映活细胞数量，从而间接检测rhKGF-1生物学活性的情况。Hoechst荧光染色法利用非嵌入性荧光染料在活细胞中DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合的原理，检测活细胞核着色情况。MTT法和CCK8法、Hoechst荧光染色法快速、简便，但前两种方法均检测的线粒体中酶的活性，后一种方法检测的是活细胞核，此三种方法直接反映的是活细胞数目。

现有技术文献：Biomimetic Delivery of Keratinocyte Growth Factor upon Cellular Demand for Accelerated Wound Healing in Vitro and in Vivo.(Am J Pathol 2005,167:1575–1586)中公开了使用Hoechst荧光检测法检测Amgen公司生产的rhKGF-1对4MBr-5的促细胞增殖活性。

现有技术文献：重组人角质细胞生长因子在毕赤酵母中的表达、纯化及活性测定(中国病理生理杂志2012，28(8):1526-1531)中公开了使用MTT法检测由巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)重组表达的rhKGF-1对4MBr-5细胞的促增殖活性。

以上现有技术均直接反映的是活细胞数目，并不完全等同于细胞的增殖数，由于活细胞包括处于凋亡边缘和没有完全凋亡的细胞，因此，不能直接反映细胞的增殖情况。所以，利用以上方法检测rhKGF-1生物学活性时，检测背景较高、不够灵敏，检测结果也不够直观准确，不能直接真实地反映出rhKGF-1促细胞的增殖活性。

最直接精确的细胞增殖检测方法是检测新合成的DNA，可通过对DNA前体物质——脱氧胸腺嘧啶核苷进行标记，被标记后的脱氧胸腺嘧啶核苷能够掺入到正在复制中处于S期细胞的DNA中，再通过对细胞的固定和染色等处理后可被观察或量化。传统细胞核标记物主要有放射性核素(常为同位素³H掺入法)和免疫化学染色(常为5-溴-2′脱氧尿嘧啶核(BrdU)掺入法)，这两种检测方法在研究细胞周期、DNA复制、以及在检测正常或病变细胞和组织细胞的增殖中起了很大作用。