[发明专利]一种重组人角质细胞生长因子生物学活性检测方法

权利要求书

1.一种重组人角质细胞生长因子(Recombinant human keratinocyte growth factor-1，rhKGF-1)生物活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)细胞培养，在含有重组人表皮生长因子(Recombinat human Epidermal Growth Factor，rhEGF)的培养基中将恒河猴肺部支气管上皮细胞(4MBr-5细胞)培养至对数生长期；

2)取步骤1)对数生长期的4MBr-5细胞，经处理过程，接种于细胞培养板中，继续培养，所述的细胞接种于细胞培养板中的密度为1.0×10⁵/ml；

3)rhKGF-1样品经处理后，做若干个浓度梯度稀释的rhKGF-1供试品溶液，并在各稀释浓度的rhKGF-1供试品溶液中加入5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU)，以制备为含有不同浓度rhKGF-1的上样样品；所述的rhKGF-1样品处理是采用培养基将rhKGF-1样品稀释至上样起始浓度为50～100ng/ml，所述的培养基是含有胎牛血清的Ham’s F-12测试培养基，所述的胎牛血清体积比为3～7％；所述的上样样品中所含EdU浓度为10～20μM；

4)对步骤2)所述的细胞培养板进行洗涤，去除培养基；

5)将步骤3)所述的上样样品上样于步骤4)中所述的细胞培养板中，并培养孵育细胞，所述的培养孵育细胞的时间是46～48h；

6)将步骤5)所述的细胞进行固化和透化处理后，EdU进行“Click-iT”反应；

7)将步骤6)中经过处理后的细胞放置于多功能酶标仪中读取荧光强度，通过数据处理计算rhKGF-1生物学活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的培养方法是使用含有终浓度为50ng/ml rhEGF和10％胎牛血清的Ham’s F-12完全培养基，37℃、5％CO₂条件下培养所述细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的处理过程包括：

(1)吸弃培养基，用胰酶消化细胞，加入含有10％胎牛血清的Ham’s F-12培养基终止消化，并收集细胞；

(2)将上述步骤中收集的细胞，800转离心3min，用含有终浓度为50ng/mlrhEGF和10％胎牛血清的Ham’s F-12完全培养基重悬细胞沉淀，计数。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的对数生长期细胞活率≥95％；所述的继续培养是37℃、5％CO₂条件下培养22～24h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的浓度梯度稀释是3～4倍系列稀释9～10个浓度梯度。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的胎牛血清体积比为5％；所述的浓度梯度稀释是3倍系列稀释，共10个浓度梯度。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述的细胞培养板洗涤包括Ham’s F-12培养液200μl/孔洗涤细胞，洗板一次，去除培养基。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中，所述的上样样品上样量为100μl/孔。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)中，所述的细胞固化、透化及EdU的“Click-iT”反应选自EdU检测试剂盒，具体为Click-PlusEdUImaging Kits，life technologies公司。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤7)中，所述的多功能酶标仪检测，激发波长为495nm，发射波长为519nm；所述的计算rhKGF-1生物学活性的方法为绘制四参数曲线，计算半数有效浓度(concentration for 50％ofmaximal effect，EC₅₀)值。