[发明专利]一种非诊断目的的HIV抗体免疫检测方法及试剂盒

摘要

本发明涉及一种非诊断目的的HIV抗体免疫检测方法及试剂盒，该方法包括使HIV抗原特异性地捕获检测样本中的HIV抗体，然后加入生物素标记二抗，孵育形成抗原‑抗体‑生物素标记二抗复合物；在链霉亲和素存在的条件下，加入生物素化引物Biotin‑I，孵育使所述复合物与Biotin‑I结合，然后加入生物素化的发卡链Biotin‑H1和发夹链H2进行杂交反应；加入亲和素标记的辣根过氧化物酶，催化底物液显色，通过测定吸光度进行HIV抗体的定量检测。本发明将HCR引入了ELISA，利用HCR进行信号放大，实现了HIV抗体的超灵敏检测，检测下限低至9.5pg/mL，比传统ELISA约提高2个数量级。

主权项

一种非诊断目的的HIV抗体免疫检测方法，其特征在于包括：使HIV抗原特异性地捕获检测样本中的HIV抗体，然后加入生物素标记二抗，孵育形成抗原‑抗体‑生物素标记二抗复合物；在链霉亲和素存在的条件下，加入生物素化引物Biotin‑I，孵育使所述复合物与Biotin‑I结合，然后加入生物素化的发卡链Biotin‑H1和发夹链H2进行杂交反应；加入亲和素标记的辣根过氧化物酶，催化底物液显色，通过测定吸光度进行HIV抗体的定量检测；所述Biotin‑I碱基序列为5’‑TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC TTT TTT TTT T‑biotin‑3’；所述Biotin‑H1碱基序列为5’‑GTA GAG ATG CGG TGG TCC TTG AGA CAA AGT TCT CAA GGA CCA CCG CAT‑biotin‑3’；所述H2的碱基序列为5’‑TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC ATG CGG TGG TCC TTG AGA ACT TTG‑3’;所述生物素标记二抗为生物素化的羊抗人IgG或生物素化的鼠抗人IgG;将HIV抗原包被于酶标板上，用封闭液处理后，将含有HIV抗体的检测样本加入微孔板，36~38℃温育，使HIV抗原特异性地捕获HIV抗体；加入生物素标记二抗在36~38℃温育，在微孔板上形成抗原‑抗体‑生物素标记二抗复合物；所述Biotin‑H1和H2先经下述预处理：经95~98℃水浴1~3min后，立即冰浴；免疫反应之后，向微孔板中加入链霉亲和素在36~38℃温育，甩去孔中液体后拍干，加入Biotin‑I在36~38℃温育，使所述复合物与Biotin‑I结合；加入Biotin‑H1和H2，室温下反应1~3h，使Biotin‑H1和H2打开发夹结构、交替杂交，形成有缺口的双链DNA聚合物；加入亲和素标记的辣根过氧化物酶在36~38℃温育后倒出液体，加入底物缓冲液及底物液在36~38℃温育，再加入终止液，混匀后比色。