[发明专利]一种基于特异性SS-COI引物的丽草蛉PCR快速检测方法

摘要

本发明提供了一种基于特异性SS‑COI引物的丽草蛉PCR快速检测方法，包括以下步骤制备特异性SS-COI引物根据丽草蛉的线粒体DNA序列（genbankKJ592501.1），设计一对丽草蛉的特异性SS-COI引物，其包括正向引物CfF55'-TAGTTTAAGTTTATTAATTCGGG-3’反向引物CfR15'-TTGAAGATGCCAGTAATAAG-3’提取的总DNA为模板，利用正向引物CfF5和反向引物CfR1进行PCR扩增反应。本发明采用SS-COIPCR技术检测丽草蛉，该技术操作简单、快速、高效，灵敏度较高，丽草蛉的DNA最低检出浓度为0.143ng/μL。

主权项

一种基于特异性SS‑COI 引物的丽草蛉PCR快速检测方法，包括以下步骤：（1）制备特异性SS‑COI 引物：根据丽草蛉的线粒体DNA 序列（genbank:KJ592501.1），设计一对丽草蛉的特异性SS‑COI引物，其包括：正向引物CfF5 ：5'‑ TAGTTTAAGTTTATTAATTCGGG‑3’反向引物CfR1 ：5'‑ TTGAAGATGCCAGTAATAAG‑3’；（2）提取样品总DNA：在棉田采集丽草蛉，将单头虫体放入离心管中将其磨碎，用提取试剂盒提取单头虫体基因组溶液，将基因组溶液保存备用，进行PCR扩增时吸取基因组溶液作为DNA模板；（3）以步骤2）提取的总DNA为模板，利用正向引物CfF5和反向引物CfR1 进行PCR 扩增反应；PCR 反应体系以20μL计为：10×Taq PCR buffer   2.0μL；2.5mM dNTPs          1.6μL；20nM CfF5            0.3μL；20nM CfR1            0.3μL；5U/μL Taq DNA聚合酶  0.2μL；DNA模板              1.0μL；ddH2O                 用灭菌水补足20μL；（4）分析PCR产物：对PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如出现大小为250bp 的DNA 扩增条带，则表明样品为丽草蛉。