[发明专利]一种基于特异性SS-COI引物的丽草蛉PCR快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种PCR检测方法，具体为基于特异性SS-COI引物的丽草蛉PCR快速检测方法。

背景技术

丽草蛉(Chrysopa formosa Brauer)，脉翅目，草蛉科，主要分布于我国的黑龙江、辽宁、吉林、北京、河北、山东、山西、河南、湖北、天津、甘肃、新疆、上海、四川、陕西等地区。成虫和幼虫的捕食能力都很强，主要捕食蚜虫、介壳虫、红蜘蛛和多种昆虫卵，也捕食蛾类幼虫等。是田间生物防治的主要捕食性天敌。

集团内捕食(Intraguild predation,简称IGP)作用是一种更为复杂的种间关系,广泛存在于各种生态系中,充分认识IGP作用的内在本质和作用机理,对发展和完善更有效的生物防治理论和策略、增强生物控害的功能、推进生物防治工程的建设有重大的意义。而常规的肠道解剖、行为观察等传统研究方法不能准确评价草蛉之间的捕食作用。目前，对丽草蛉的特异性检测的方法尚未建立。

同时，传统的草蛉鉴定是依据形态的差异，需具有一定的专业知识才能准确鉴定，而通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术进行鉴定只需常规分子生物学方面的知识就能解决，并且准确可靠、简便快速。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种基于特异性SS-COI引物的丽草蛉PCR快速检测方法，具有检测速度快的优点。

本基于特异性SS-COI引物的丽草蛉PCR快速检测方法包括以下步骤：

(1)制备特异性SS-COI引物：根据丽草蛉的线粒体DNA序列(genbank:KJ592501.1)，设计一对丽草蛉的特异性SS-COI引物，其包括：

正向引物CfF5：5'-TAGTTTAAGTTTATTAATTCGGG-3’

反向引物CfR1：5'-TTGAAGATGCCAGTAATAAG-3’；

(2)提取样品总DNA：在棉田采集丽草蛉，将单头虫体放入离心管中将其磨碎，用提取试剂盒提取单头虫体基因组溶液，将基因组溶液保存备用，进行PCR扩增时吸取基因组溶液作为DNA模板；

(3)以步骤2)提取的总DNA为模板，利用正向引物CfF5和反向引物CfR1进行PCR扩增反应；PCR反应体系以20μL计为：

(4)分析PCR产物：对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如出现大小为250bp的DNA扩增条带，则表明样品为丽草蛉。

在上述的基于特异性SS-COI引物的丽草蛉PCR快速检测方法中，所述步骤(1)中，通过genbank的KJ592501.1，结合DNA条形码技术中的通用引物：

LepF1：(5'-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’)和

LepR1：(5'-AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’)

扩增出丽草蛉的COI产物，进行多条引物设计，从中筛选出特异性SS-COI引物，即正向引物CfF5和反向引物CfR1。

在上述的基于特异性SS-COI引物的丽草蛉PCR快速检测方法中，所述步骤(3)中PCR反应条件为：首先，94℃3分钟；其次，94℃30秒，51℃30秒，72℃1分钟，共45循环次；最后，72℃10分钟。

与现有的技术相比，本发明的优点在于：采用SS-COI PCR技术检测丽草蛉，该技术操作简单、快速、高效，灵敏度较高，丽草蛉的DNA最低检出浓度为0.143ng/μL。

附图说明

图1为本发明丽草蛉特异性引物CfF5/CfR1的PCR检测结果图。其中，M：100bp DNA ladder；1-64为表1中序号所对应昆虫的扩增结果，-为阴性对照。

图2为本发明丽草蛉特异性引物CfF5/CfR1的DNA浓度梯度检测结果图。其中，M：100bp DNA ladder；1-8为丽草蛉DNA原模板浓度89.54ng/μL依次4倍稀释浓度梯度，-为阴性对照。

具体实施方式

如图1、图2所示，本方案包括以下步骤：

(1)制备特异性SS-COI引物：根据丽草蛉的线粒体DNA序列(genbank:KJ592501.1)，设计一对丽草蛉的特异性SS-COI引物，其包括：

正向引物CfF5：5'-TAGTTTAAGTTTATTAATTCGGG-3’