[发明专利]一种基于特异性SS-COI引物的丽草蛉PCR快速检测方法

权利要求书

1.一种基于特异性SS-COI 引物的丽草蛉PCR快速检测方法，包括以下步骤：

（1）制备特异性SS-COI 引物：根据丽草蛉的线粒体DNA 序列（genbank:KJ592501.1），设计一对丽草蛉的特异性SS-COI引物，其包括：

正向引物CfF5 ：5'- TAGTTTAAGTTTATTAATTCGGG-3’

反向引物CfR1 ：5'- TTGAAGATGCCAGTAATAAG-3’；

（2）提取样品总DNA：在棉田采集丽草蛉，将单头虫体放入离心管中将其磨碎，用提取试剂盒提取单头虫体基因组溶液，将基因组溶液保存备用，进行PCR扩增时吸取基因组溶液作为DNA模板；

（3）以步骤2）提取的总DNA为模板，利用正向引物CfF5和反向引物CfR1 进行PCR 扩增反应；

PCR 反应体系以20μL计为：

10×Taq PCR buffer 2.0μL；

2.5mM dNTPs1.6μL；

20nM CfF50.3μL；

20nM CfR10.3μL；

5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL；

DNA模板1.0μL；

ddH₂O 用灭菌水补足20μL；

（4）分析PCR产物：对PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如出现大小为250bp 的DNA 扩增条带，则表明样品为丽草蛉。

2.根据权利要求1所述的基于特异性SS-COI 引物的丽草蛉PCR快速检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中，通过genbank的KJ592501.1，结合DNA条形码技术中的通用引物：

LepF1：（5'-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’）和

LepR1：（5'-AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’）

扩增出丽草蛉的COI产物，进行多条引物设计，从中筛选出特异性SS-COI引物，即正向引物CfF5和反向引物CfR1。

3.根据权利要求1所述的基于特异性SS-COI 引物的丽草蛉PCR快速检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中PCR 反应条件为：首先，94℃3分钟；其次，94℃30秒，51℃30秒，72℃1分钟，共45循环次；最后，72℃10分钟。