[发明专利]一种利用脉冲电场进行微生物育种的方法

摘要

本发明涉及一种微生物诱变育种的方法，特别涉及一种利用脉冲电场诱变微生物的方法，包括以下步骤：（1）样品的制备；（2）诱变操作；（3）诱变条件优选；（4）诱变菌的分离和筛选。本发明所述脉冲电场诱变微生物的方法具有以下优点：得到的正向突变菌株生产目标产物的能力更强，其产量可提高2.5倍；遗传稳定性好，经15代传代后产量稳定；处理后的微生物不需要避光培养，简化实验操作；具有操作简单、安全、无污染、设备和实验成本低的特点，将在工业微生物诱变育种领域发挥更大的作用。

主权项

一种利用脉冲电场进行微生物育种的方法，其特征是，包括以下步骤：(1)样品的制备将菌体活化后，采用0.85％生理盐水十倍梯度稀释、平板计数法获得菌液浓度，用0.85％生理盐水适当稀释菌液获得10²‑10³CFU/mL的菌悬液，取100μL涂布固体培养基，培养至对数生长期后期，制得单菌落；(2)诱变操作1)设置空调温度为25℃，调节室温；2)将脉冲电场下极板用75％酒精擦拭，这里的下极板即为载物台；3)将步骤1制得的单菌落放在载物台中央，调节上极板使极板间距为4mm；4)设置脉冲宽度0‑50μs、脉冲电场电压为0‑5kV、频率为100‑1000Hz；5)对样品进行电场处理，诱变时间为0‑120s；(3)诱变条件优选将经诱变处理后的单菌落置于装有10mL灭菌液体培养基的试管中，涡旋使菌体分散、混匀，培养至稳定期后期，测量发酵液中目标产物的含量，以未经电场处理的原始菌株做对照试验，根据实验结果确定适宜的脉冲电场诱变电压、脉冲频率和处理时间；(4)诱变菌的分离和筛选采用步骤(3)优选所得脉冲电场诱变条件，按照步骤(2)诱变处理单菌落，将诱变后的单菌落分散于10mL灭菌生理盐水中，并适当稀释得到10³CFU/mL菌悬液，取0.1mL菌悬液涂布于固体培养基上，培养至稳定期，随机挑取单菌落于装有10mL灭菌液体培养基的试管中培养，获得突变菌株种子菌液，再将种子菌液接种于发酵培养基中培养进行发酵培养，测量发酵液中发酵产物的含量，根据所测得的目标产物的产量或质量确定目的菌株。