[发明专利]一种利用脉冲电场进行微生物育种的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物诱变育种的方法，特别涉及一种利用脉冲电场诱变 微生物的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

微生物菌种是发酵工业的基础和关键，因此微生物育种工作的开展十分重 要。诱变育种不仅可以用于提高代谢产物的产量，而且可以用来改善产品质量、 扩大品种以及简化工艺，具有简便易行、收效显著、成本低、诱变方式多等优 点。根据诱变剂的不同可将诱变育种划分为物理诱变、化学诱变和生物诱变。 大多数的化学诱变剂都是致癌物质或剧毒药品，对人体和环境具有潜在危害； 生物诱变剂应用面偏窄，不能广泛用于菌种选育；物理诱变方法设备简单、操 作方便、安全性高且诱变效果好，是目前工业微生物育种最为常用的诱变手段。 但是，长期、重复使用某种诱变源，往往导致突变率低、突变谱窄和抗性饱和。 因此，需要开发新型、高效的诱变方法。

目前，脉冲电场主要用于杀菌(如连续食品灭菌CN200910096711.2、荔汁 液非热杀菌CN201410752465.2、针对单增李氏特菌CN201410421710.1等)、活 性物质提取(如葡萄皮渣多酚CN201310140746.8、多糖CN201310569144.4、人 参皂苷CN201410639581.3)和米糠油提取(如CN201410289492.0)及钝酶(如申 请人取得的高压脉冲电场处理糙米稳定米糠的方法”ZL200810122654.6和“微 波、紫外线和高压脉冲电场联合处理糙米稳定米糠的方法” (ZL200810122657.X)等方面。

脉冲电场(pulsedelectricfield，PEF)技术是一项冷加工技术，是对置于处理 室中的物料反复施加电脉冲的过程。PEF处理会诱导细胞膜电击穿，因此PEF 技术被作为一种物理灭菌手段用于食品杀菌领域，具有低温、操作简便、无毒 性及杀灭效果好等优点。将脉冲电场用于微生物诱变育种是一个崭新的技术， 目前还没有相关报道。

发明内容

本发明的目的就是针对上述问题，提供一种利用脉冲电场进行微生物育种 的方法，采用脉冲电场诱变微生物的方法，是以脉冲电场作用于待诱变微生物， 得到突变微生物。

本发明的目的是这样实现的，一种利用脉冲电场进行微生物育种的方法， 其特征是，包括以下步骤：

(1)样品的制备

将菌体活化后，采用0.85％生理盐水十倍梯度稀释、平板计数法获得菌液浓 度，用0.85％生理盐水适当稀释菌液获得10²-10³CFU/mL的菌悬液，取100μL 涂布固体培养基，培养至对数生长期后期，制得单菌落；

(2)诱变操作

1)设置空调温度为25℃，调节室温；

2)将脉冲电场下极板用75％酒精擦拭，这里的下极板即为载物台；

3)将步骤1制得的单菌落放在载物台中央，调节上极板使极板间距为4mm；

4)设置脉冲宽度0-50μs、脉冲电场电压为0-5kV、频率为100-1000Hz；

5)对样品进行电场处理，诱变时间为0-120s；

(3)诱变条件优选

将经诱变处理后的单菌落置于装有10mL灭菌液体培养基的试管中，涡旋 使菌体分散、混匀，培养至稳定期后期，测量发酵液中目标产物的含量，以未 经电场处理的原始菌株做对照试验，根据实验结果确定适宜的脉冲电场诱变电 压、脉冲频率和处理时间；

(4)诱变菌的分离和筛选

采用步骤(3)优选所得脉冲电场诱变条件，按照步骤(2)诱变处理单菌 落，将诱变后的单菌落分散于10mL灭菌生理盐水中，并适当稀释得到10³CFU/mL菌悬液，取0.1mL菌悬液涂布于固体培养基上，培养至稳定期，随机 挑取单菌落于装有10mL灭菌液体培养基的试管中培养，获得突变菌株种子菌 液，再将种子菌液接种于发酵培养基中培养进行发酵培养，测量发酵液中发酵 产物的含量，根据所测得的目标产物的产量或质量确定目的菌株。

使用脉冲电源进行诱变，该诱变条件为：

(1)采用均强脉冲电场，一般操作设置电压0-5kV控制电场强度为0-15 kV/cm、脉冲频率100-1000Hz、脉冲宽度0-50μs、处理时间为0-120s、构成脉 冲电场的平行极板间距为0-10cm可调，这里的平行极板包括上极板、下极板；