[发明专利]一种利用脉冲电场进行微生物育种的方法

权利要求书

1.一种利用脉冲电场进行微生物育种的方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)样品的制备

将菌体活化后，采用0.85％生理盐水十倍梯度稀释、平板计数法获得菌液浓 度，用0.85％生理盐水适当稀释菌液获得10²-10³CFU/mL的菌悬液，取100μL 涂布固体培养基，培养至对数生长期后期，制得单菌落；

(2)诱变操作

1)设置空调温度为25℃，调节室温；

2)将脉冲电场下极板用75％酒精擦拭，这里的下极板即为载物台；

3)将步骤1制得的单菌落放在载物台中央，调节上极板使极板间距为4mm；

4)设置脉冲宽度0-50μs、脉冲电场电压为0-5kV、频率为100-1000Hz；

5)对样品进行电场处理，诱变时间为0-120s；

(3)诱变条件优选

将经诱变处理后的单菌落置于装有10mL灭菌液体培养基的试管中，涡旋 使菌体分散、混匀，培养至稳定期后期，测量发酵液中目标产物的含量，以未 经电场处理的原始菌株做对照试验，根据实验结果确定适宜的脉冲电场诱变电 压、脉冲频率和处理时间；

(4)诱变菌的分离和筛选

采用步骤(3)优选所得脉冲电场诱变条件，按照步骤(2)诱变处理单菌 落，将诱变后的单菌落分散于10mL灭菌生理盐水中，并适当稀释得到10³CFU/mL菌悬液，取0.1mL菌悬液涂布于固体培养基上，培养至稳定期，随机 挑取单菌落于装有10mL灭菌液体培养基的试管中培养，获得突变菌株种子菌 液，再将种子菌液接种于发酵培养基中培养进行发酵培养，测量发酵液中发酵 产物的含量，根据所测得的目标产物的产量或质量确定目的菌株。

2.根据权利要求1所述的一种利用脉冲电场进行微生物育种的方法，其特 征是，使用脉冲电源进行诱变，该诱变条件为：

(1)采用均强脉冲电场，一般操作设置电压0-5kV控制电场强度为0-15 kV/cm、脉冲频率100-1000Hz、脉冲宽度0-50μs、处理时间为0-120s、构成脉 冲电场的平行极板间距为0-10cm可调，这里的平行极板包括上极板、下极板；

(2)温度为室温，可以通过调节室内温度调节处理温度；

(3)诱变样品为菌龄为对数生长后期的单菌落。

3.根据权利要求1所述的一种利用脉冲电场进行微生物育种的方法，其特 征是，所述步骤(1)中，用0.85％生理盐水适当稀释菌液获得10²-10³CFU/mL 的菌悬液，优选5×10²CFU/mL的菌悬液。