[发明专利]实时荧光定量PCR鉴别蕲蛇的方法

摘要

本发明提供了一种实时荧光定量PCR鉴别蕲蛇的方法，旨在提供一种具有操作简单、时间短、准确率高，不易造成污染的实时荧光定量PCR鉴别蕲蛇的方法，该方法依次包括下述步骤：1)引物稀释放-20℃保存备用；2)样品前处理取试样中段的肌肉组织剪碎，加入研钵中研成粉末，称取30mg至2ml灭菌离心管中；3)模板DNA提取前处理好的样品，提取DNA,置-20℃保存备用；4)配置PCR反应液配；5)加模板往上述PCR管中加入2μl提取好的DNA，加样顺序为阴性对照、待检样品、阳性对照，敲打PCR管盒，使反应液与DNA混匀，并经3000转离心30秒，立即进行PCR反应；6)荧光定量PCR测试；7)结果判定；属于化学检测技术领域。

主权项

一种实时荧光定量PCR鉴别蕲蛇的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：1)引物稀释放‑20℃保存备用；2)样品前处理取试样中段的肌肉组织剪碎，加入研钵中研成粉末，称取30mg至2ml灭菌离心管中；3)模板DNA提取前处理好的样品，提取DNA,置‑20℃保存备用；4)配置PCR反应液配每次PCR实验需要阴性对照、阳性对照各一个，共制备7管，按照以上顺序依次加入试剂至干净的离心管中，涡旋振荡混匀后，放冰盒上待用；将灭菌的PCR八联管固定在PCR管盒上，将冰盒上的反应液离心后，打开盖子，加至PCR管中，每管18μl；5)加模板往上述PCR管中加入2μl提取好的DNA，加样顺序为阴性对照、待检样品、阳性对照，敲打PCR管盒，使反应液与DNA混匀，并经3000转离心30秒，立即进行PCR反应；6)荧光定量PCR测试仪器参数：检测模式为荧光通道，反应总体积为20μl，染色，依次选择“预变性”和“二步扩增”，收集荧光；PCR反应参数：95℃预变4min，然后进行45个循环：95℃变性30s，63℃复性45s并采集荧光；7)结果判定阴性对照需无Cq值，曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期；阳性对照需Cq≤30，曲线有明显指数扩增期；无Cq值，曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期，可报告样品阴性；Cq值≤36，曲线有明显指数扩增期，可直接报告样品阳性。