[发明专利]实时荧光定量PCR鉴别蕲蛇的方法

说明书

技术领域

本发明提供一种鉴别蕲蛇的方法，具体的说是实时荧光定量 PCR鉴别蕲蛇的方法；属于化学检测技术领域。

背景技术

蕲蛇为为蝰科类动物五步蛇的干燥体,具有祛风、通络、止痉 的功效。由于其药用价值较高，导致近年来被大量捕捉，药材资源 不断减少，大量伪品充斥着市场，质量问题日益严重。传统的蕲蛇 药材的鉴别，主要是对其头部、鳞片和骨骼的形态特征进行性状鉴 别，这对实验人员的中药材鉴别经验及蕲蛇药材的完整性要求较 高。随着分子生物学的发展，使得中药材的分子遗传标记鉴别成为 可能。

一直以来，蕲蛇的传统鉴别方法为形态学鉴别,由于市场上的蕲 蛇特别是经过炮制后的产品，多除去了头、鳞、骨，外观形态上已 经发生了很大的改变，这对药材的鉴别带来了较大的困难。文献上 已经引入了PCR方法来鉴别蕲蛇，对于不能通过性状、显微来鉴别 真伪的，只需要有特定的引物和相关试剂，经过模板DNA提取、 PCR反应和电泳检测3个步骤即可完成鉴别。但是，相比较qPCR 而言，普通PCR法使用的仪器较多，需要PCR仪、电泳仪、凝胶 成像仪或紫外透射仪等，且时间不少于2小时。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的是提供一种具有操作简单、时间 短、准确率高，不易造成污染的实时荧光定量PCR鉴别蕲蛇的方 法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：

一种实时荧光定量PCR鉴别蕲蛇的方法，依次包括下述步骤：

1)引物稀释放-20℃保存备用；

2)样品前处理取试样中段的肌肉组织剪碎，加入研钵中研成粉 末，称取30mg至2ml灭菌离心管中；

3)模板DNA提取前处理好的样品，提取DNA,置-20℃保存备 用；

4)配置PCR反应液配

每次PCR实验需要阴性对照、阳性对照各一个，共制备7管， 按照以上顺序依次加入试剂至干净的离心管中，涡旋振荡混匀后， 放冰盒上待用；将灭菌的PCR八联管固定在PCR管盒上，将冰盒 上的反应液离心后，打开盖子，加至PCR管中，每管18μl；

5)加模板往上述PCR管中加入2μl提取好的DNA，加样顺序 为阴性对照、待检样品、阳性对照，敲打PCR管盒，使反应液与 DNA混匀，并经3000转离心30秒，立即进行PCR反应；

6)荧光定量PCR测试

仪器参数：检测模式为荧光通道，反应总体积为20μl， SYBRGreenI染色，依次选择“预变性”和“二步扩增”，收集荧 光；PCR反应参数：95℃预变4min，然后进行45个循环：95℃变 性30s，63℃复性45s并采集荧光；

7)结果判定

阴性对照需无Cq值，曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长 期；

阳性对照需Cq≤30，曲线有明显指数扩增期；

无Cq值，曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期，可报告 样品阴性；

2.7.4Cq值≤36，曲线有明显指数扩增期，可直接报告样品阳 性。

进一步的，上述的一种实时荧光定量PCR鉴别蕲蛇的方法，所 述的八联管为0.2ml离心管。

进一步的，上述的一种实时荧光定量PCR鉴别蕲蛇的方法，其 特征在于，所述的试剂动物组织基因组DNA提取试剂盒购自广州迪 奥生物科技有限公司，型号：DePureTissueDNAKit。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案qPCR只需要一台仪 器，就能完成整个试验流程，实验花费的时间减少一半，操作简 单，样品经过前处理，放入仪器1小时后即可进行分析，无须开盖 转移样本，避免污染，且能每时每刻记录样本的荧光值变化。本研 究对3个蕲蛇正品和2个混伪品的鉴别准确率为100％，且经多次重 复测试，重现性好，说明该方法对鉴别蕲蛇的真伪是可行有效的。

附图说明

图1是蕲蛇阳性品扩增曲线图。

图2是蕲蛇阴性品扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细 说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护 范围所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。

实施例1

1.材料与仪器

1.1材料