[发明专利]实时荧光定量PCR鉴别蕲蛇的方法

权利要求书

1.一种实时荧光定量PCR鉴别蕲蛇的方法，其特征在于，依 次包括下述步骤：

1)引物稀释放-20℃保存备用；

2)样品前处理取试样中段的肌肉组织剪碎，加入研钵中研成粉 末，称取30mg至2ml灭菌离心管中；

3)模板DNA提取前处理好的样品，提取DNA,置-20℃保存备 用；

4)配置PCR反应液配

每次PCR实验需要阴性对照、阳性对照各一个，共制备7管， 按照以上顺序依次加入试剂至干净的离心管中，涡旋振荡混匀后， 放冰盒上待用；将灭菌的PCR八联管固定在PCR管盒上，将冰盒 上的反应液离心后，打开盖子，加至PCR管中，每管18μl；

5)加模板往上述PCR管中加入2μl提取好的DNA，加样顺序 为阴性对照、待检样品、阳性对照，敲打PCR管盒，使反应液与 DNA混匀，并经3000转离心30秒，立即进行PCR反应；

6)荧光定量PCR测试

仪器参数：检测模式为荧光通道，反应总体积为20μl，染色， 依次选择“预变性”和“二步扩增”，收集荧光；PCR反应参数： 95℃预变4min，然后进行45个循环：95℃变性30s，63℃复性45s 并采集荧光；

7)结果判定

阴性对照需无Cq值，曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长 期；

阳性对照需Cq≤30，曲线有明显指数扩增期；

无Cq值，曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期，可报告 样品阴性；

Cq值≤36，曲线有明显指数扩增期，可直接报告样品阳性。

2.根据权利要求1所述的一种实时荧光定量PCR鉴别蕲蛇的 方法，其特征在于，所述的八联管为0.2ml离心管。

3.根据权利要求1所述的一种实时荧光定量PCR鉴别蕲蛇的 方法，其特征在于，所述的试剂动物组织基因组DNA提取试剂盒购 自广州迪奥生物科技有限公司。