[发明专利]一种高效的4-雄烯二酮菌种选育方法

摘要

本发明提供了一种高效的4-雄烯二酮菌种选育方法，所述方法包括：菌种的培养、诱变处理、诱变菌种培养液的涂布与培养、单菌落接种及摇床发酵和发酵液的萃取与薄层层析五个步骤。采用本发明的方法，使用微型发酵管，一次摇床实验可以培养上千个微型发酵管，提高了单位时间内菌种培养的数量，缩短了对预设数目菌种培养的时间，因此提高了菌种筛选的效率。同时由于本发明的方法使用了微型发酵管，可以在发酵结束后，直接将溶剂添加到微型发酵管中进行提取，简化了提取步骤，节省了操作时间。另外本发明的方法采用双向薄层层析法替代高效液相法，实验人员每天可检测数百个样品，提高了菌种筛选的速度，菌种筛选的效率得到大幅度提高。

主权项

一种高效的4‑雄烯二酮菌种选育方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)、菌种的培养：将甘油管内分支杆菌的种子接种于含有种子培养基的第一摇瓶中，将所述第一摇瓶放置于第一摇床上振荡培养，所述第一摇床的转速为150～190r/min，温度为28～32℃，培养时间为20～48h，得到菌种培养液；步骤(2)、诱变处理：用无菌生理盐水稀释所述种子液得到种子稀释液，对所述种子稀释液进行诱变处理，得到诱变菌种培养液；步骤(3)、诱变菌种培养液的涂布与培养：用灭菌后的含量为1％～2％(v/v)的甘油水溶液稀释所述诱变菌种培养液，并将稀释后的不同浓度的诱变菌种培养液涂布在分离平板培养基上，将装载有所述分离平板培养基的平板倒置于28℃～32℃培养箱中，培养3‑7天；步骤(4)、单菌落接种及摇床发酵：从所述分离平板上选取单菌落，将选中的单菌落接种到装有分离平板培养基的的无菌培养皿中以供后续使用，并同时将此单菌落接种在装有发酵培养基的微型发酵管中，所述发酵培养基中含有植物甾醇，之后盖上透气管盖，将所述微型发酵管摆放在特制摇床板上，进一步将所述特制摇床板放入第二摇床上，所述第二摇床的温度为28℃～32℃，转速为150～190r/min，旋转时间为4～7天，得到发酵液，其中每个特制摇床板可放置100‑200个所述微型发酵管；每层摇床可放置4块所述特制摇床板；步骤(5)、发酵液的萃取与薄层层析：待发酵结束后，将所述微型发酵管取下，向每个微型发酵管中加入乙酸乙酯进行萃取，盖上密闭管盖，将密闭的微型发酵管放于漩涡混合器上混合，混合结束后静置分层，从乙酸乙酯层中取样，采用双向层析的方法对样品进行检测，判断不同微型发酵管内的菌种将植物甾醇转化为4‑雄烯二酮的能力，进一步筛选出转化能力较强的所需菌种。