[发明专利]一种高效的4-雄烯二酮菌种选育方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物发酵医药技术领域，特别是涉及一种高效的4-雄烯二酮 菌种选育方法。

背景技术

4-雄烯二酮是生产甾体激素类药物的重要中间体。目前我国的年产量大 约为3000-4000吨，该中间体除了满足国内制药企业的需求外，还有一定量 的出口。

目前4-雄烯二酮的生产主要采用微生物生物转化工艺，即发酵工艺，以 植物甾醇为原料，在分支杆菌的作用下，将植物甾醇降解为4-雄烯二酮。然 后再通过有机溶剂提取，将4-雄烯二酮从发酵液中提取出来，并精制成为合 格的中间体产品。

4-雄烯二酮的发酵水平主要取决于菌种的生产能力，只有不断地进行菌 种选育，才能获得产量提高的高产菌种，从而提高4-雄烯二酮的发酵水平。

菌种选育的主要方法为诱变育种，即采用物理诱变剂或化学诱变剂处理 微生物菌种，使其基因发生突变，然后从大量的突变菌种中筛选出极少数的 产量提高了的突变菌种，经验证后用于发酵生产，从而提高发酵水平。

获得高产突变菌种的主要难点是：微生物在经过诱变剂处理后，基因突 变发生的位点不确定，导致突变后菌种的生理生化特性变化不确定，对4- 雄烯二酮产量的影响不确定；而且在突变菌种中，绝大多数突变菌株对4- 雄烯二酮的生产能力没有变化或者降低，只有极少数的突变菌种对4-雄烯二 酮的生产能力得到提高，此种突变菌种出现的几率极低，约为千分之一至万 分之一。因此，常规的诱变育种方法需要使用大量的人工，进行大量的筛选 工作，需要数月或数年的时间，才能偶然获得一株高产菌种。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效的4-雄烯二酮菌种选育方 法，以全部或部分解决上述技术问题。

为了解决上述问题，本发明公开了一种高效的4-雄烯二酮菌种选育方 法，包括以下步骤：

步骤(1)、菌种的培养：将甘油管内分支杆菌的种子接种于含有种子培 养基的第一摇瓶中，将所述第一摇瓶放置于第一摇床上振荡培养，所述第一 摇床的转速为150～190r/min，温度为28～32℃，培养时间为20～48h，得 到菌种培养液；

步骤(2)、诱变处理：用无菌生理盐水稀释所述种子液得到种子稀释液， 对所述种子稀释液进行诱变处理，得到诱变菌种培养液；

步骤(3)、诱变菌种培养液的涂布与培养：用灭菌后的含量为1％～2％ (v/v)的甘油水溶液稀释所述诱变菌种培养液，并将稀释后的不同浓度的诱 变菌种培养液涂布在分离平板培养基上，将装载有所述分离平板培养基的平 板倒置于28℃～32℃培养箱中，培养3-7天；

步骤(4)、单菌落接种及摇床发酵：从所述分离平板上选取单菌落，将 选中的单菌落接种到装有分离平板培养基的无菌培养皿中以供后续使用，并 同时此单菌落接种在装有发酵培养基的微型发酵管中，所述发酵培养基中含 有植物甾醇，之后盖上透气管盖，将所述微型发酵管摆放在特制摇床板上， 进一步将所述特制摇床板放入第二摇床上，所述第二摇床的温度为28℃～ 32℃，转速为150～190r/min，旋转时间为4～7天，得到发酵液，其中每个 特制摇床板可放置100-200个所述微型发酵管；每层摇床可放置4块所述特 制摇床板；

步骤(5)、发酵液的萃取与薄层层析：待发酵结束后，将所述微型发酵 管取下，向每个微型发酵管中加入乙酸乙酯进行萃取，盖上密闭管盖，将密 闭的微型发酵管放于漩涡混合器上混合，混合结束后静置分层，从乙酸乙酯 层中取样，采用双向层析的方法对样品进行检测，判断不同微型发酵管内的 菌种将植物甾醇转化为4-雄烯二酮的能力，进一步筛选出转化能力较强的所 需菌种。

可选地，在所述步骤(5)中，所述双向层析的方法包括：

绘制硅胶板：在硅胶板的上部和下部分别画出一条平行于长边的边线， 并在每条边线上均匀标记预设数目的标记点，再于两条边线的中间画出一条 平行于所述长边的中线；

取样和点样：使用不同毛细管吸取不同样品，按照所述样品的吸取顺序， 依次将吸取的样品点样在两条边线的标记点上，同时将所述植物甾醇和所述 4-雄烯二酮作为对照溶液，分别点样在剩余的标记点上，点样完成后吹干处 理；