[发明专利]一种高效的4-雄烯二酮菌种选育方法

权利要求书

1.一种高效的4-雄烯二酮菌种选育方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)、菌种的培养：将甘油管内分支杆菌的种子接种于含有种子培 养基的第一摇瓶中，将所述第一摇瓶放置于第一摇床上振荡培养，所述第一 摇床的转速为150～190r/min，温度为28～32℃，培养时间为20～48h，得 到菌种培养液；

步骤(2)、诱变处理：用无菌生理盐水稀释所述种子液得到种子稀释液， 对所述种子稀释液进行诱变处理，得到诱变菌种培养液；

步骤(3)、诱变菌种培养液的涂布与培养：用灭菌后的含量为1％～2％ (v/v)的甘油水溶液稀释所述诱变菌种培养液，并将稀释后的不同浓度的诱 变菌种培养液涂布在分离平板培养基上，将装载有所述分离平板培养基的平 板倒置于28℃～32℃培养箱中，培养3-7天；

步骤(4)、单菌落接种及摇床发酵：从所述分离平板上选取单菌落，将 选中的单菌落接种到装有分离平板培养基的的无菌培养皿中以供后续使用， 并同时将此单菌落接种在装有发酵培养基的微型发酵管中，所述发酵培养基 中含有植物甾醇，之后盖上透气管盖，将所述微型发酵管摆放在特制摇床板 上，进一步将所述特制摇床板放入第二摇床上，所述第二摇床的温度为 28℃～32℃，转速为150～190r/min，旋转时间为4～7天，得到发酵液，其 中每个特制摇床板可放置100-200个所述微型发酵管；每层摇床可放置4块 所述特制摇床板；

步骤(5)、发酵液的萃取与薄层层析：待发酵结束后，将所述微型发酵 管取下，向每个微型发酵管中加入乙酸乙酯进行萃取，盖上密闭管盖，将密 闭的微型发酵管放于漩涡混合器上混合，混合结束后静置分层，从乙酸乙酯 层中取样，采用双向层析的方法对样品进行检测，判断不同微型发酵管内的 菌种将植物甾醇转化为4-雄烯二酮的能力，进一步筛选出转化能力较强的所 需菌种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(5)中，所 述双向层析的方法包括：

绘制硅胶板：在硅胶板的上部和下部分别画出一条平行于长边的边线， 并在每条边线上均匀标记预设数目的标记点，再于两条边线的中间画出一条 平行于所述长边的中线；

取样和点样：使用不同毛细管吸取不同样品，按照所述样品的吸取顺序， 依次将吸取的样品点样在两条边线的标记点上，同时将所述植物甾醇和所述 4-雄烯二酮作为对照溶液，分别点样在剩余的标记点上，点样完成后吹干处 理；

展层处理：先将所述硅胶板的一边放入层析缸中进行展层，待溶剂的前 沿升至所述中线时，取出所述硅胶板并吹干；再将所述硅胶板的另一边放入 所述层析缸中进行展层，待所述溶剂的前沿升至中线时，取出所述硅胶板并 吹干；

菌种筛选：用10％～40％(v/v)的硫酸水溶液喷于所述硅胶板的表面， 然后将所述硅胶板放入烘箱内进行加热显影，烘箱温度为100～130℃，烘烤 时间为10～20min，显影后根据4-雄烯二酮斑点和剩余的植物甾醇斑点的大 小判定菌种的转化能力，选取转化能力较强的所需菌种，其中所述植物甾醇 斑点越小，同时所述4-雄烯二酮斑点越大，表明所述菌种的转化能力越强。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述硅胶板的尺寸为100mm×200mm，包括40个标记点；

所述溶剂包括环己烷和乙酸乙酯，所述环己烷和所述乙酸乙酯的体积比 为3:1.5～3:2.5。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微型发酵管为耐高 温灭菌的透明塑料管；

所述透气管盖设有开孔，在所述开孔中放置棉花，用于通气并防止染菌。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特制摇床板的长度 为420mm，宽度为260mm，厚度为25mm，每块所述特征摇床板上设置有 128个用于放置所述微型发酵管的凹槽；

所述第二摇床为双层摇床，每层可放置4块所述特征摇床板，所述第二 摇床可放置1024个所述微型发酵管。