[发明专利]一种16型、18型HPV病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法

摘要

本发明提供一种16型、18型HPV病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法，通过检索NCBI 16型、18型HPV基因组序列，获取HPV E6/E7基因序列信息，分别以31-934位点区域和41-980位点区域构建16型、18型HPV E6/E7标准品质粒，参照所得16型、18型HPV E6/E7目的基因序列，分别在上述位点区域内设计16型、18型HPV E6、E7荧光定量PCR特异性引物，利用所得16型、18型HPV E6/E7标准品质粒分别检测宫颈癌患者组织样品的16型、18型HPV病毒拷贝数。该检测体系的建立既可以通过检测E6基因，又可以通过检测E7基因，来达到对宫颈癌患者组织中的HPV DNA拷贝数进行绝对定量的目的，从而对宫颈癌的早防、早治提供参考。

主权项

一种16型、18型HPV病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法，其特征在于经过下列各步骤：（1）构建16型、18型HPV E6/E7标准品质粒：a．根据NCBI数据库中16型HPV （NCBI Reference Sequence： NC_001526.2）和18型HPV（GenBank：AY262282.1）基因序列，针对E6/E7基因区，按下述设计特异性引物：16型HPV E6/E7的PCR正、反向引物：HPV16 E6/E7For：5'‑CGT AAC CGA AAT CGG TTG AAC‑3'HPV16 E6/E7Rev：5'‑CAG CCT CTA CAT AAA ACC ATC‑3'18型HPV E6/E7的PCR正、反向引物：HPV18 E6/E7For：5'‑AAC CGA AAA CGG TCG GGA CC‑3'HPV18 E6/E7Rev：5'‑TAG CTT GTA CAT AAA ACC AGC‑3'；b．宫颈癌组织中总DNA的提取：先将1 mL HPV组织保存液吸入1.5 mL灭菌的EP管中，以13000rpm在4℃下离心5min；弃上清，向沉淀中加入1mL Tris‑HCl 洗涤缓冲液，以13000rpm在4℃下离心5min；弃上清，再加入1mL Tris‑HCl洗涤缓冲液，以13000rpm在4℃下离心5min，弃上清；向沉淀中加入200 µL浓度为0.1mg/mL的蛋白酶K裂解液，在50℃下消化过夜；然后以95℃沸水煮沸变性10min；再以13000rpm在4℃下离心5min，将上清转移至0.5 mL EP管中，在‑70℃下冻存，得到16型、18型HPV基因组DNA；c．将步骤b所得16型、18型HPV基因组DNA通过PCR的方法，利用步骤a的特异性引物分别扩增16型、18型HPV E6/E7基因，分别得到对应的扩增产物，再将扩增产物分别连接到pMD‑18T Vector克隆载体上，转化DH5α感受态细胞，挑单克隆进行测序鉴定，分别获得16型、18型HPV目的基因序列鉴定正确的阳性菌株；d．将步骤（1）c所得序列鉴定正确的阳性菌株分别进行常规培养，分别获得16型、18型HPV标准品质粒，并用紫外分光光度计分别测定16型、18型HPV标准品质粒的浓度，再按下列公式计算标准品质粒的拷贝数：Number of copies（copies/μl） = (Amount×6.022×10²³)/（Length×1×10⁹×650）其中，Amount为紫外分光光度计测得标准品质粒所测含量（ng/μl），Length代表模板DNA长度；（2）参照步骤（1）c所得16型、18型HPV目的基因序列分别设计下列16型、18型HPV E6和E7的荧光定量PCR特异性引物：16型：HPV16 E6For：5'‑TGC GAC GTG AGG TAT ATG ACT TTG‑3'     HPV16 E6Rev：5'‑ACG GTT TGT TGT ATT GCT GTT CTA‑3'16型：HPV16 E7For：5'‑TTA GAT TTG CAA CCA GAG ACA‑3'     HPV16 E7Rev：5'‑GCA CAA CCG AAG CGT AGA GTC‑3'18型：HPV18 E6For：5'‑ACA TTG GAA AAA CTA ACT AAC‑3'     HPV18 E6Rev：5'‑TGC AGC ACG AAT GGC ACT GG‑3'18型：HPV18 E7For：5'‑AAT TCC GGT TGA CCT TCT ATG‑3'     HPV18 E7Rev：5'‑GCT CAA TTC TGG CTT CAC ACT T‑3'（3）利用步骤（1）d所得16型、18型HPV标准品质粒分别检测宫颈癌组织中的E6和E7拷贝数，具体检测方法如下：a．将步骤（1）d所得16型、18型HPV标准品质粒分别用双蒸水按梯度稀释至10^‑6，按PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测标准品质粒扩增效率和特异性，通过荧光定量PCR检测直接获得16型、18型HPV标准品质粒的扩增曲线与溶解曲线，同时根据荧光定量PCR检测所得标准品Ct值作为X轴，标准品拷贝数log₁₀作为Y轴分别绘制16型、18型HPV标准品质粒的标准曲线，进而得到16型、18型HPV标准品质粒的标准曲线方程：所述PCR反应体系如表1：表1 荧光定量PCR反应体系（反应总体积为20μl）成分体积模板1 μl步骤（3）的荧光定量PCR特异性正向引物（10μM）1 μl步骤（3）的荧光定量PCR特异性反向引物（10μM）1 μl2×SYBR green Master Mix10 μl双蒸水7 μl采用的反应程序如下：b．按步骤（3）a提供的PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测宫颈癌组织DNA，分别根据步骤（3）a利用标准品质粒得到标准曲线和标准曲线方程，进而获得宫颈癌组织中HPV DNA的拷贝数。