[发明专利]一种16型、18型HPV病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法

权利要求书

1.一种16型、18型HPV病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法，其特征在于经过下列各步 骤：

（1）构建16型、18型HPVE6/E7标准品质粒：

a．根据NCBI数据库中16型HPV（NCBIReferenceSequence：NC_001526.2）和18型HPV （GenBank：AY262282.1）基因序列，针对E6/E7基因区，按下述设计特异性引物：

16型HPVE6/E7的PCR正、反向引物：

HPV16E6/E7For：5'-CGTAACCGAAATCGGTTGAAC-3'

HPV16E6/E7Rev：5'-CAGCCTCTACATAAAACCATC-3'

18型HPVE6/E7的PCR正、反向引物：

HPV18E6/E7For：5'-AACCGAAAACGGTCGGGACC-3'

HPV18E6/E7Rev：5'-TAGCTTGTACATAAAACCAGC-3'；

b．宫颈癌组织中总DNA的提取：先将1mLHPV组织保存液吸入1.5mL灭菌的EP管中，以 13000rpm在4℃下离心5min；弃上清，向沉淀中加入1mLTris-HCl洗涤缓冲液，以13000rpm 在4℃下离心5min；弃上清，再加入1mLTris-HCl洗涤缓冲液，以13000rpm在4℃下离心 5min，弃上清；向沉淀中加入200μL浓度为0.1mg/mL的蛋白酶K裂解液，在50℃下消化过夜； 然后以95℃沸水煮沸变性10min；再以13000rpm在4℃下离心5min，将上清转移至0.5mLEP 管中，在-70℃下冻存，得到16型、18型HPV基因组DNA；

c．将步骤b所得16型、18型HPV基因组DNA通过PCR的方法，利用步骤a的特异性引物分别 扩增16型、18型HPVE6/E7基因，分别得到对应的扩增产物，再将扩增产物分别连接到pMD- 18TVector克隆载体上，转化DH5α感受态细胞，挑单克隆进行测序鉴定，分别获得16型、18 型HPV目的基因序列鉴定正确的阳性菌株；

d．将步骤（1）c所得序列鉴定正确的阳性菌株分别进行常规培养，分别获得16型、18型 HPV标准品质粒，并用紫外分光光度计分别测定16型、18型HPV标准品质粒的浓度，再按下列 公式计算标准品质粒的拷贝数：

Numberofcopies（copies/μl）=(Amount×6.022×10²³)/（Length×1×10⁹×650）

其中，Amount为紫外分光光度计测得标准品质粒所测含量（ng/μl），Length代表模板 DNA长度；

（2）参照步骤（1）c所得16型、18型HPV目的基因序列分别设计下列16型、18型HPVE6和 E7的荧光定量PCR特异性引物：

16型：HPV16E6For：5'-TGCGACGTGAGGTATATGACTTTG-3'

HPV16E6Rev：5'-ACGGTTTGTTGTATTGCTGTTCTA-3'

16型：HPV16E7For：5'-TTAGATTTGCAACCAGAGACA-3'

HPV16E7Rev：5'-GCACAACCGAAGCGTAGAGTC-3'

18型：HPV18E6For：5'-ACATTGGAAAAACTAACTAAC-3'

HPV18E6Rev：5'-TGCAGCACGAATGGCACTGG-3'

18型：HPV18E7For：5'-AATTCCGGTTGACCTTCTATG-3'

HPV18E7Rev：5'-GCTCAATTCTGGCTTCACACTT-3'

（3）利用步骤（1）d所得16型、18型HPV标准品质粒分别检测宫颈癌组织中的E6和E7拷贝 数，具体检测方法如下：

a．将步骤（1）d所得16型、18型HPV标准品质粒分别用双蒸水按梯度稀释至10^-6，按PCR反 应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测标准品质粒扩增效率和特异性，通过荧光定量PCR检 测直接获得16型、18型HPV标准品质粒的扩增曲线与溶解曲线，同时根据荧光定量PCR检测 所得标准品Ct值作为X轴，标准品拷贝数log₁₀作为Y轴分别绘制16型、18型HPV标准品质粒的 标准曲线，进而得到16型、18型HPV标准品质粒的标准曲线方程：

所述PCR反应体系如表1：

表1荧光定量PCR反应体系（反应总体积为20μl）

成分 体积 模板 1 μl 步骤（3）的荧光定量PCR特异性正向引物（10μM） 1 μl 步骤（3）的荧光定量PCR特异性反向引物（10μM） 1 μl 2×SYBR green Master Mix 10 μl 双蒸水 7 μl

采用的反应程序如下：

b．按步骤（3）a提供的PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测宫颈癌组织DNA，分 别根据步骤（3）a利用标准品质粒得到标准曲线和标准曲线方程，进而获得宫颈癌组织中 HPVDNA的拷贝数。

2.根据权利要求1所述的绝对定量检测方法，其特征在于：所述步骤（3）a中用双蒸水按 梯度稀释至10^-6是指将16型、18型HPV标准品质粒分别用双蒸水稀释成以下梯度：10^-1、10^-2、 10^-3、10^-4、10^-5、10^-6。