[发明专利]一种16型、18型HPV病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒诊断技术领域，具体涉及16型、18型HPV病毒基因拷贝数的绝对定 量检测方法。

背景技术

人乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是导致宫颈癌的一个重要因素。在 全球范围内，宫颈癌的每年新发病例约50万人，死亡例数约25万人，在妇科肿瘤中发病率居 第2位。

HPV是球形DNA病毒，其基因组全长约8000bp，包括6个早期基因(E1、E2、E4、E5、E6 及E7)开放式阅读框(open-readingframe，ORF)、2个晚期基因(L1、L2)开放式阅读框以及1 个非编码长控制区(non-codinglongcontrolregion，LCR)，其中，E6、E7基因为两个主要 的原癌基因。

HPV主要感染皮肤及粘膜鳞状上皮，分为2大类，皮肤型和粘膜型。粘膜型主要感染 人泌尿生殖道的黏膜上皮，导致与泌尿生殖器官相关的多种疾病。根据与癌症发生的关系 大小，粘膜型HPV分为高危型(high-risk，HR)和低危型(low-risk，LR)。高危型主要有HPV- 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66型；低危型主要有HPV-6、11、40、42、43、44、 54、61、70、72和81型。分子流行病学和病毒学研究发现，HPV感染宫颈可发展为宫颈癌，与 HPV型别有关，宫颈鳞状细胞癌患者中，HPV-16型和HPV-18型为主要感染亚型。

目前，对人乳头状瘤病毒的常用病原学检测方法主要有聚合酶链反应 (PolymeraseChainReaction，PCR)、核酸杂交检测(包括核酸印迹原位杂交、斑点杂交、原 味杂交、杂交捕获等)。核酸杂交检测方法操作复杂，而PCR检测方法操作简便且灵敏度较 高，可以进行HPV分型，实时PCR检测可以初步对病毒拷贝数进行相对定量。但是，该方法由 于没有设计病毒拷贝数的标准对照参比品以及拷贝数计算体系，因而对于病毒绝对拷贝数 的具体信息未能知晓。

发明内容

本发明旨在针对16型、18型HPVE6/E7基因构建标准品质粒，建立16型、18型HPV 荧光定量PCR绝对定量体系，该检测体系的建立既可以通过检测E6基因，又可以通过检测E7 基因，为临床快速断定宫颈癌患者受到HPV病毒感染，并对宫颈癌患者组织中HPVDNA拷贝 数进行绝对定量，从而为宫颈癌的早防、早治提供技术支持。

本发明通过下列技术方案实现：一种16型、18型HPV病毒基因拷贝数的绝对定量检 测方法，经过下列各步骤：

(1)构建16型、18型HPVE6/E7标准品质粒：

a.根据NCBI数据库中16型HPV(NCBIReferenceSequence：NC_001526.2)和18型 HPV(GenBank：AY262282.1)基因序列，针对E6/E7区，按下述设计特异性引物：

16型HPVE6/E7的PCR正、反向引物：

HPV16E6/E7For：5'-CGTAACCGAAATCGGTTGAAC-3'

HPV16E6/E7Rev：5'-CAGCCTCTACATAAAACCATC-3'

18型HPVE6/E7的PCR正、反向引物：

HPV18E6/E7For：5'-AACCGAAAACGGTCGGGACC-3'

HPV18E6/E7Rev：5'-TAGCTTGTACATAAAACCAGC-3'；

b.宫颈癌组织中总DNA的提取：先将1mLHPV组织保存液吸入1.5mL灭菌的EP管中， 以13000rpm在4℃下离心5min；弃上清，向沉淀中加入1mLTris-HCl洗涤缓冲液(pH8.1)， 以13000rpm在4℃下离心5min；弃上清，再加入1mLTris-HCl洗涤缓冲液，以13000rpm在4℃ 下离心5min，弃上清；向沉淀中加入200μL浓度为0.1mg/mL的蛋白酶K裂解液，在50℃下消化 过夜；然后以95℃沸水煮沸变性10min；再以13000rpm在4℃下离心5min，将上清转移至 0.5mLEP管中，在-70℃下冻存，得到16型、18型HPV基因组DNA；