[发明专利]一种安水金线鲃脾脏细胞系的构建方法

摘要

本发明涉及一种安水金线鲃脾脏细胞系的构建方法，该构建方法包括如下步骤：1)安水金线鲃脾脏的获取：采用酒精直接对鱼体进行消毒；2)原代培养：采用含有谷氨酰胺、胎牛血清、青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B的L‑15培养液进行培养；3)传代培养：传至第8代时，细胞培养液换成基础培养液，所述安水金线鲃脾脏细胞系建立成功。本发明的构建方法所获得的安水金线鲃脾脏细胞系能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，不仅能满足对安水金线鲃这一珍稀物种种质资源保存和理论研究的需要，更重要的是该细胞系是中国首个洞穴鱼类的细胞系，为细胞水平的洞穴适应性研究奠定了基础。

主权项

1.一种安水金线鲃脾脏细胞系的构建方法，该构建方法包括如下步骤：1)安水金线鲃脾脏的获取：先用80‑120ppm的MS‑222麻醉安水金线鲃；以75％酒精消毒鱼体后，取其脾脏，加入HBSS消毒液浸泡脾脏组织；浸泡15‑30分钟后，将脾脏组织用HBSS消毒液清洗3‑5次；2)原代培养：将通过1)获得的脾脏组织剪成100mm3的组织小块，并将其接种于细胞培养瓶中，在18‑24℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液，在18‑24℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换所述原代培养液，第6‑9天细胞开始从组织块中迁移，20‑40天长成细胞单层；3)传代培养：原代脾脏细胞铺满瓶底80％后开始传代，先吸出培养瓶中的原代培养液，以含0.1‑0.2％的胰蛋白酶的胰酶消化法悬起细胞细胞变圆后，加入传代培养液1‑2ml以中和胰酶反应，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代，于18‑24℃培养箱中继续培养；每4‑6天传代一次，传至第8代时，细胞培养液换成基础培养液，所述安水金线鲃脾脏细胞系建立成功，其中所述HBSS消毒液为含有浓度为100‑300IU/ml的青霉素、浓度为100‑300μg/ml的链霉素、浓度为20‑40μg/ml的庆大霉素以及浓度为20‑40μg/ml的两性霉素B的Hanks平衡盐溶液，其中所述基础培养液为含有占总体积的10‑15％的胎牛血清和浓度为300‑400mg/l的谷氨酰胺的L‑15培养液，其中所述原代培养液为含有占总体积的15‑25％的胎牛血清、浓度为600‑800mg/l的谷氨酰胺、浓度为100‑200IU/ml的青霉素、浓度为100‑300μg/ml的链霉素、浓度为20‑40μg/ml的庆大霉素以及浓度为20‑40μg/ml的两性霉素B的L‑15培养液，其中所述传代培养液为含有占总体积的10‑20％的胎牛血清、浓度为500‑600mg/l的谷氨酰胺、浓度为20‑40μg/ml的庆大霉素以及浓度为20‑40μg/ml的两性霉素B的L‑15培养液，其中所述原代培养液、所述传代培养液和所述基础培养液的pH值为7.2‑7.4，渗透压为280‑360mOsm/l。