[发明专利]一种安水金线鲃脾脏细胞系的构建方法

说明书

本发明涉及一种安水金线鲃脾脏细胞系的构建方法，该构建方法包括如下步骤：1)安水金线鲃脾脏的获取：采用酒精直接对鱼体进行消毒；2)原代培养：采用含有谷氨酰胺、胎牛血清、青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B的L‑15培养液进行培养；3)传代培养：传至第8代时，细胞培养液换成基础培养液，所述安水金线鲃脾脏细胞系建立成功。本发明的构建方法所获得的安水金线鲃脾脏细胞系能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，不仅能满足对安水金线鲃这一珍稀物种种质资源保存和理论研究的需要，更重要的是该细胞系是中国首个洞穴鱼类的细胞系，为细胞水平的洞穴适应性研究奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种利用安水金线鲃脾脏组织建立细胞系的方法，属于淡水水生生物细胞培养和超低温冷冻保存的技术领域。

背景技术

安水金线鲃Sinocyclocheilus anshuiensis(Regan，1904)隶属于鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)金线鲃属(Sinocyclocheilus)，是2013年发表的一盲鱼新种，目前，本种已知的分布点仅为广西壮族自治区凌云县逻楼镇安水村一洞穴，对它的研究也仅见于其分类特征的描述和分类地位的确认。

因安水金线鲃种群数量较小，且不易获得，因此，如何保护和保存这一珍稀洞穴鱼类的种质资源成为现今亟待解决的问题。塘养环境下，安水金线鲃还不能实现性腺的正常发育成熟，实现更进一步的人工繁殖还存在一定困难，因此，通过保存其精子、卵子、胚胎、个体等来保存其种质资源的方法已不可行，所以发明人将目光投向了安水金线鲃的体细胞培养。

鱼类细胞培养起于20世纪60年代，发展至今已建立了280余株细胞系，中国的鱼类细胞培养历经30多年，只建立了50余株细胞系，建立细胞系的物种不足中国鱼类总数的1.5％(中国鱼类超过3500种)，由此可见，细胞系的构建速度是非常缓慢的，关注度不够、参与的工作者较少可能是其原因之一；其次，相较于哺乳动物细胞培养，鱼类细胞培养中更易发生污染，导致失败率上升，而现有的专利或文章中大多将这一现象归结为技术不过关，而嫌少注重鱼体本身的质量问题，在安水金线鲃细胞培养实践中，鱼体的生活状态也直接影响了细胞系构建的成败；另外，因安水金线鲃野外生境的局限性，对其生活习性的了解较少，这也在一定程度上加大了安水金线鲃细胞培养的难度。因此，安水金线鲃脾脏细胞系的成功构建是建立在长期对安水金线鲃野生和塘养生态习性了解的基础上，同时，安水金线鲃是中国首个实现细胞培养的盲鱼，此细胞系也是中国首个盲鱼的细胞系。经文献检索，未见与本发明的相同报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简便易行的安水金线鲃脾脏细胞系的构建方法，以满足对安水金线鲃快速核型分析、种质资源保存和洞穴适应性研究的需要。

具体地，根据本发明的一个方面，提供了一种安水金线鲃脾脏细胞系的构建方法，该构建方法包括如下步骤：1)安水金线鲃脾脏的获取：先用80-120ppm的MS-222麻醉安水金线鲃；以75％酒精消毒鱼体后，取其脾脏，加入HBSS消毒液浸泡脾脏组织；浸泡15-30分钟后，将脾脏组织用HBSS消毒液清洗3-5次；2)原代培养：将通过1)获得的脾脏组织剪成约100mm3的组织小块，并将其接种于细胞培养瓶中，在18-24℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液，在18-24℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换所述原代培养液，第6-9天细胞开始从组织块中迁移，20-40天长成细胞单层；3)传代培养：原代脾脏细胞铺满瓶底80％后开始传代，先吸出培养瓶中的原代培养液，以含0.1-0.2％的胰蛋白酶的胰酶消化法悬起细胞，细胞变圆后，加入传代培养液1-2ml以中和胰酶反应，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代，于18-24℃培养箱中继续培养；每4-6天传代一次，传至第8代时，细胞培养液换成基础培养液，所述安水金线鲃脾脏细胞系建立成功。

进一步地，所述HBSS消毒液为含有浓度为100-300IU/ml的青霉素、浓度为100-300μg/ml的链霉素、浓度为20-40μg/ml的庆大霉素以及浓度为20-40μg/ml的两性霉素B的Hanks平衡盐溶液。